球孢白僵菌過氧化氫酶BbcatA的功能分析.pdf

1、作為經(jīng)典的絲狀昆蟲病原真菌，球孢白僵菌因易于生產(chǎn)和環(huán)境友好等優(yōu)點而在農(nóng)林害蟲防治中廣泛應(yīng)用。昆蟲病原真菌抗逆的分子機理直接關(guān)系到生防菌劑的田間穩(wěn)定性和應(yīng)用效果。作為細胞抗氧化酶系的主要成員之一，過氧化氫酶在細胞抵抗活性氧自由基(ROS)脅迫過程中發(fā)揮著重要的作用。然而，目前罕見關(guān)于球孢白僵菌過氧化氫酶基因及其功能的研究報道，其對生防真菌抗逆生性狀的貢獻知之甚少。為此，本論文試從以過氧化氫酶基因為切入點，利用同源重組的方法敲除球孢白僵菌過

2、氧化氫酶基因BbcatA，通過過氧化氫酶基因的缺失對菌株的抗逆力和毒力產(chǎn)生的影響，解析BbcatA的表達調(diào)控，為菌株改良提高提供了新的基因資源。主要研究內(nèi)容及結(jié)果如下：
　　 BbcatA基因的克隆與表達調(diào)控通過序列比對及簡并引物擴增，從球孢白僵菌Bb2860菌株基因組中克隆到單功能大亞基過氧化氫酶BbcatA基因，全長2235 bp，含1個60bp的內(nèi)含子。ORF全長2175bp，編碼724個氨基酸，編碼蛋白質(zhì)的分子量和等電點

3、分別為80.7kDa和6.8。該蛋白與其它絲狀真菌的孢子特異性過氧化氫酶具有較高的同源性，與番茄葉霉病菌catA的同源性最高。BbcatA蛋白結(jié)構(gòu)具有其它真菌過氧化氫酶結(jié)構(gòu)中典型的血紅素接合位點和氨基酸殘基保守序列。氨基酸序列比對分析顯示，BbcatA系CAT家族Ⅱ組的成員，屬于單功能過氧化氫酶。
　　 BbcatA在菌絲中轉(zhuǎn)錄表達的前兩天保持較高的水平，第3天急劇減少，在此后的4天里又逐步增強，但都達不到第二天的水平。在50m

4、M H202的刺激下，基因表達水平顯著變化，脅迫1小時后的基因表達水平為空白對照的2.5倍；隨著脅迫時間的的延長，BbCatA基因的表達水平進一步升高，脅迫3小時的表達水平為空白對照的4.5倍。結(jié)果表明，BbcatA參與H202氧化脅迫的防御。
　　 BbcatA基因敲除及突變株表型分析應(yīng)用根癌農(nóng)桿菌介導的遺傳轉(zhuǎn)化方法成功構(gòu)建BbcatA的缺失突變株△BbcatA。在萌發(fā)實驗中，△BbcatA的分生孢子對H202十分敏感，H20

5、2的半致死濃度LC50比野生株下降42.2％。在紫外輻射與熱脅迫實驗中，△BbcatA的分生孢子對UV-B輻射的耐受力比野生株降低51.7％，對45℃熱脅迫的半致死時間LT50比野生株降低37％。在生物測定中，△BbcatA分生孢子接種斜紋夜蛾二齡幼蟲的致死率為59.8％，而野生株分生孢子的致死率為86.9％;△BbcatA對斜紋夜蛾二齡幼蟲的LT50為6.4天，比野生株延長1.4天，表明BbcatA在較大程度上影響菌株的毒力。