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1、鱖(Siniperca chuatsi)是我國(guó)重要的名貴淡水經(jīng)濟(jì)魚類。近年來(lái),鱖常受到細(xì)菌、病毒等病害的影響,對(duì)鱖的養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展產(chǎn)生了極大的影響,造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。本文采用 RACE-PCR的方法克隆了鱖兩個(gè)重要的抗氧化酶—CAT和 GPX的 cDNA序列全長(zhǎng),分析了 CAT和 GPX mRNA在鱖組織內(nèi)的表達(dá);另外,對(duì) CAT基因進(jìn)行了原核表達(dá)。
1.鱖 CAT cDNA全長(zhǎng)為2216bp,包括編碼區(qū)1581bp,3’端非翻
2、譯區(qū)635bp,含有典型的腺苷酸信號(hào)序列 AATAAA和 PolyA尾。該基因序列開(kāi)放閱讀框(ORF)編碼527個(gè)氨基酸,預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)分子量為59.8 kDa,等電點(diǎn)為7.26。BLAST分析顯示鱖 CAT氨基酸序列和其它物種 CAT基因有很高的同源性。氨基酸序列分析發(fā)現(xiàn)鱖 CAT存在高度保守的過(guò)氧化氫酶近端血紅素配體簽名序列(354RLFSYPDTH362)和過(guò)氧化氫酶近端活性位點(diǎn)(64FDRERIPERVVHAKGAG80)以及3個(gè)催
3、化位點(diǎn)殘基“ H”、“ N”和“ Y”。另外,還有三個(gè)糖基化位點(diǎn)(148 NNTP151)、(439NFTQ442)和(507 NTTV510),12個(gè)NADPH結(jié)合位點(diǎn)和過(guò)氧化物酶體靶信號(hào) SKM。系統(tǒng)發(fā)育樹結(jié)果表明鱖與條石鯛的親緣關(guān)系最近。實(shí)時(shí)熒光定量 PCR檢測(cè)鱖 CAT的 mRNA在組織中表達(dá)情況,結(jié)果顯示鱖 CAT的 mRNA在9種組織中均有表達(dá),其中在肝臟表達(dá)量較高。最后,構(gòu)建了 ScCAT+pET-30a重組質(zhì)粒并熱激轉(zhuǎn)入
4、大腸桿菌 BL21(DE3)中,成功地誘導(dǎo)出了 ScCAT的天然可溶性重組蛋白,可用于后續(xù)重組蛋白的純化、分析及抗體生產(chǎn)。
2.谷胱甘肽過(guò)氧化物酶是生物體機(jī)體抗氧化防御系統(tǒng)主要的酶類之一。鱖GPX基因 cDNA序列全長(zhǎng)為948 bp,開(kāi)放閱讀框564 bp,3′非編碼區(qū)384 bp,密碼子 TGA編碼1個(gè)硒半胱氨酸( Sec),不是終止密碼子;3′非編碼區(qū)形成1個(gè)硒半胱氨酸插入序列(SECIS元件)。鱖 GPX氨基酸序列的硒半
5、胱氨酸插入序列元件屬于 form1,與其它魚類相比具有較高的同源性。氨基酸結(jié)構(gòu)分析顯示,鱖 GPX有 Sec催化位點(diǎn) Gln71和 Trp148、穩(wěn)定酶三級(jí)結(jié)構(gòu)的3個(gè)環(huán)、PGGG結(jié)構(gòu)域和由 Sec、Trp、Gln與 Asn構(gòu)成的催化四聯(lián)體。鱖 GPX與脊椎動(dòng)物 GPX1和 GPX2氨基酸序列同源性為66%-91%。系統(tǒng)進(jìn)化分析顯示,GPX聚為3大支, GPX1、GPX2和 GPX3聚為一支,GPX4獨(dú)為一支。實(shí)時(shí)熒光定量 PCR檢測(cè)鱖G
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