His-tag標(biāo)記的嗜熱菌來源L-脯氨酸脫氫酶的純化與性質(zhì)研究及生物感應(yīng)器構(gòu)建的研究.pdf

1、L-脯氨酸脫氫酶是一種生物體中廣泛存在的酶，能在有電子接收體存在的情況下氧化L-脯氨酸。從日本溫泉附近采集的超嗜熱菌Thermococcus profundus，通過基因工程手段在其色素依存性L-脯氨酸脫氫酶基因片段中引入Hig-tag做標(biāo)記并將該質(zhì)粒提取純化。采用E.coliRosetta-gami(DE3)Competent Cells菌株進(jìn)行質(zhì)粒轉(zhuǎn)換并培養(yǎng)，超聲菌體破碎，熱處理后使用Ni sepharose分離，得到純度較高的Hi

2、s-tagL-脯氨酸脫氫酶(Dye-linked L-pro DH)。純化后的酶液經(jīng)凝膠電泳得到分離，分離片段為58.6 kDa，40.2 kDa,22.3 kDa，與理論值吻合。證明了His-tag和鎳離子具有較強(qiáng)特異性結(jié)合，達(dá)到了較明顯的純化效果，為今后對該酶的定向固定化應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。
　　 對該酶的性質(zhì)在溫度，緩沖體系pH值和緩沖溶液種類的選擇上作了初步探索，得出最適宜酶活溫度為50℃，300 mM的Tris緩沖溶液和pH

3、值為8.0。
　　 利用物理吸附的方法將純化后的His-tag L-脯氨酸脫氫酶固定在多壁碳納米管(MCNT)修飾的玻碳電極表面。研究發(fā)現(xiàn)：在pH7.5濃度300mM的磷酸緩沖溶液中，加入底物L(fēng)-脯氨酸后，修飾電極上發(fā)生了可逆的氧化還原反應(yīng)，表明His-tag L-脯氨酸脫氫酶在修飾電極上保持了自身的生物活性，并且多壁碳納米管起到了良好電子傳遞體功能。為了驗(yàn)證該酶的His-tag的定向固定化性能，進(jìn)行了石英晶體微天平(QCM)實(shí)