蘋果L-半乳糖脫氫酶基因全長(zhǎng)cDNA的克隆及正、反義表達(dá)載體的構(gòu)建.pdf

1、蘋果(MaluspumilaMill.)屬薔薇科薔薇屬植物。抗壞血酸(AsA)俗稱維生素C，在植物抵抗氧化脅迫、增強(qiáng)光合保護(hù)、調(diào)節(jié)細(xì)胞的分裂、生長(zhǎng)過程以及信號(hào)傳遞等方面都具有非常重要的作用。最近幾年對(duì)AsA在植物中的功能及AsA生物合成途徑研究得較深入，在此基礎(chǔ)上，以提高植物中AsA含量為目的的相關(guān)基因工程研究將為進(jìn)行提高農(nóng)產(chǎn)品中維生素C含量、改善農(nóng)作物的營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)、增強(qiáng)其抗逆性等方面的研究打下基礎(chǔ)。 L-半乳糖脫氫酶是AsA合成

2、的L-半乳糖途徑中催化L-半乳糖生成L-半乳糖內(nèi)酯的關(guān)鍵酶。本試驗(yàn)以嘎拉蘋果葉片為材料，通過RT-PCR法克隆了調(diào)控AsA合成的L-半乳糖脫氫酶基因，進(jìn)行了序列分析，并且構(gòu)建了正義和反義表達(dá)載體。為進(jìn)一步研究該酶的分子結(jié)構(gòu)、功能、表達(dá)特點(diǎn)以及通過轉(zhuǎn)化研究植物合成和積累AsA的分子機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。 本試驗(yàn)獲得的主要結(jié)果有： 1.用RT-PCR法從蘋果葉片中克隆出L-半乳糖脫氫酶的cDNA全長(zhǎng)，其全長(zhǎng)cDNA序列包含一個(gè)長(zhǎng)度

3、為972bp的開放閱讀框(ORF)，編碼324個(gè)氨基酸。該片段與GenBank中其它植物的L-半乳糖脫氫酶基因核苷酸序列同源性分析表明該序列與獼猴桃的同源性為81％，與辣椒的同源性為80％，與菠菜的同源性為78％。 2.借助PMD18-T載體將L-半乳糖脫氫酶基因的完整ORF序列正向插入到植物表達(dá)載體pSB166的多克隆位點(diǎn)上，構(gòu)建了含有GalDH全長(zhǎng)cDNA的植物正義表達(dá)載體。并經(jīng)酶切、PCR鑒定，已導(dǎo)入農(nóng)桿菌。 3.