華支睪吸蟲乳酸脫氫酶（CsLDH）結(jié)構(gòu)和生物學(xué)功能研究.pdf

1、研究目的：探討華支睪吸蟲乳酸脫氫酶做為藥物靶標(biāo)分子的機(jī)制。在蛋白定位的基礎(chǔ)上研究吡喹酮、左旋咪唑、阿苯達(dá)唑、芬苯達(dá)唑、甲苯咪唑等藥物對重組的CsLDH酶促功能的影響，期望了解這些藥物的分子作用機(jī)制。 研究方法 1、華支睪吸蟲乳酸脫氫酶(CsLDH)基因的生物信息學(xué)分析 應(yīng)用在線核酸蛋白分析工具以及專門的生物信息學(xué)應(yīng)用軟件中相關(guān)程序(如：BLASTx程序、Translation程序和Alignx程序等等)對CsLD

2、H和其他物種LDH序列進(jìn)行同源比對，分析該蛋白的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)、抗原表位、功能域、分子進(jìn)化關(guān)系以及蛋白質(zhì)的三級結(jié)構(gòu)，進(jìn)而預(yù)測其生物學(xué)功能。 2、華支睪吸蟲乳酸脫氫酶(CsLDH)定位及結(jié)構(gòu)研究 2.1華支睪吸蟲乳酸脫氫酶(CsLDH)亞細(xì)胞及蟲體組織定位 2.1.1 CsLDH的真核克隆、表達(dá)和鑒定 從cDNA文庫當(dāng)中擴(kuò)增出CsLDH基因，應(yīng)用分子克隆技術(shù)構(gòu)建pEGFP-N1-CsLDH真核表達(dá)質(zhì)粒。脂質(zhì)體法將

3、重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HeLa細(xì)胞，用倒置熒光顯微鏡觀察培養(yǎng)24h和72h蛋白的表達(dá)，比較其與對照載體pEGFP-N1表達(dá)的差異。以RT-PCR鑒定轉(zhuǎn)染pEGFP-N1-CsLDH質(zhì)粒的HeLa細(xì)胞中CsLDH基因在mRNA水平的表達(dá)。 2.1.2 GFP-CsLDH亞細(xì)胞定位轉(zhuǎn)染 pEGFP-N1-CsLDH重組質(zhì)粒的HeLa細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)24h后，一抗用CsLDH免疫兔血清，二抗用橙色熒光Cy3羊抗兔IgG(H+L)，免疫細(xì)胞化

4、學(xué)法間接檢測CsLDH在HeLa中的定位。 2.1.3 CsLDH的免疫組織定位 解剖感染華支睪吸蟲的貓，將在新鮮貓肝中的華支睪吸蟲成蟲分離、固定后用石蠟包埋切片。一抗用CsLDH免疫兔血清，二抗用橙色熒光Cy3羊抗兔IgG(H+L)，免疫熒光組織化學(xué)法間接法檢測CsLDH在華支睪吸蟲蟲體的定位。 2.2 CsLDH拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)研究 2.2.1 E10-20及E94-102表位克隆表達(dá)和純化 合成E1

5、0-20及E94-102各自對應(yīng)的正反兩條DNA鏈，退火后獲得酶切后的目的片段。將經(jīng)分子克隆技術(shù)獲得構(gòu)建的pGEX-4T-1-E10-20及pGEX-4T-1-E94-102重組質(zhì)粒，進(jìn)行原核表達(dá)，SDS-PAGE鑒定表達(dá)的重組蛋白，上清液經(jīng)親和層析純化，獲得目的蛋自。 2.2.3 CsLDH免疫血清 E10-20和E94-102的免疫反應(yīng)性檢測；E10-20和E94-102免疫血清與CsLDH的免疫反應(yīng)性檢測分別將與E

6、10-20、E94-102和CsLDH免疫SD大鼠獲得免疫血清，以Western blotting和間接ELISA法檢測CsLDH免疫血清對E10-20和E94-102的識別；同法檢測E10-20和E94-102的免疫血清對CsLDH蛋白的識別。 2.2.4 E10-20、E94-102與CsLDH免疫血清對CsLDH催化丙酮酸還原成乳酸的影響 在標(biāo)準(zhǔn)酶活性反應(yīng)體系中，加入不同稀釋度的E10-20、E94-102與CsL

7、DH免疫血清，對重組CsLDH催化丙酮酸還原成乳酸的酶活性進(jìn)行測定，計算不同稀釋度血清對重組CsLDH活性的影響。 2.2.5鑒定E10-20和E94-102在華支睪吸蟲成蟲定位解剖感染華支睪吸蟲的貓，將在新鮮貓肝中的華支睪吸蟲成蟲分離、固定后用石蠟包埋切片，一抗用E10-20和E94-102免疫大鼠血清，二抗用橙色熒光AlexaFluor@555羊抗大鼠IgG(H+L)，免疫熒光組織化學(xué)法間接檢測E10-20和E94-102在

8、華支睪吸蟲成蟲組織中的定位。 3、抗吸蟲藥物對于重組CsLDH作用研究 在標(biāo)準(zhǔn)的酶活性反應(yīng)體系中，加入不同濃度的吡喹酮、左旋咪唑、阿苯達(dá)唑、芬苯達(dá)唑和甲苯咪唑，對重組CsLDH催化的丙酮酸還原及乳酸氧化反應(yīng)的酶活性進(jìn)行測定，設(shè)不同藥物對應(yīng)的溶劑作為對照，計算不同藥物濃度作用下NADH在340nm處吸光度的變化，SPSS 16.0對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。 研究結(jié)果 1、華支睪吸蟲乳酸脫氫酶(CsLDH)基因的生

9、物信息學(xué)分析 Blastx分析該基因?yàn)槿L基因，ORF從第79位到1062位含有984bp，編碼328aa，理論分子量為35.6kDa。蛋白質(zhì)序列與其他物種的LDH進(jìn)行多重序列比對，發(fā)現(xiàn)其與SjLDH的一致性最高，達(dá)74％。蛋白質(zhì)序列含有其他物種LDH共有的保守位點(diǎn)，其中第102R(精氨酸)、162D(天冬氨酸)和189H(組氨酸)在空間位置上相互靠近，形成酶的活性中心。InterProSean在線分析表明該氨基酸序列有4個L-

10、乳酸脫氫酶／蘋果酸脫氫酶保守的催化位點(diǎn)，拓?fù)鋵W(xué)結(jié)構(gòu)分析該蛋白含有三個跨膜區(qū)V25GSVGMASAFALMEITG42、S124PNCIIVVVSNPVDVIXY141和Y243TSWAIGLTCRSLCNAIL260，N端位于膜內(nèi)(i)，C端位于膜外(o)。在空間位置上，此三個跨膜區(qū)形成一個通道結(jié)構(gòu)。親水性分析表明，CsLDH具有三個高親水性表位，分別為12aa-20aa、94aa-102aa以及10aa-18aa，94aa-102aa

11、位于膜外部分，可能是主要的抗原表位。 2、華支睪吸蟲乳酸脫氫酶(CsLDH)結(jié)構(gòu)研究 設(shè)計引物從cDNA文庫中擴(kuò)增出CsLDH目的基因，瓊脂糖凝膠電泳鑒定DNA條帶在1000bp左右，定向克隆獲得的真核表達(dá)質(zhì)粒pEGFP-N1-CsLDH，PCR、雙酶切和測序鑒定證實(shí)重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。pEGFP-N1-CsLDH轉(zhuǎn)染HeLa細(xì)胞后培養(yǎng)24h在倒置熒光顯微鏡下觀察可見綠色熒光分布于細(xì)胞核以外部位，而72h后在部分細(xì)胞的細(xì)胞

12、膜上可見弱的綠色熒光；而轉(zhuǎn)染pEGFP-N1質(zhì)粒的HeLa細(xì)胞在24h和72h觀察綠色熒光均勻分布于細(xì)胞內(nèi)。轉(zhuǎn)染了pEGFP-N1-CsLDH質(zhì)粒的HeLa細(xì)胞檢測到了CsLDH在mRNA水平的表達(dá)。細(xì)胞免疫組化表明CsLDH定位于HeLa細(xì)胞膜上。蟲體免疫組化表明CsLDH主要分布在蟲體表膜，口、腹吸盤、咽及腸支。將來源于CsLDH的兩個表位基因片段定向克隆至pGEX-4T-1載體，獲得重組的原核表達(dá)質(zhì)粒pGEX-4T-1-E10-2

13、0及pGEX-4T-1-E94-102，經(jīng)測序鑒定證實(shí)重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。在1mmol／L IPTG、37℃下誘導(dǎo)表達(dá)重組融合蛋白，15％SDS-PAGE分析表達(dá)產(chǎn)物在26kDa處，超聲裂解上清中有相應(yīng)表達(dá)條帶，證實(shí)可溶性表達(dá)獲得成功。表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)親和層析純化，獲得目的蛋白。經(jīng)Western blotting和ELISA法分析，融合表達(dá)的E10-20及E94-102可以被CsLDH免疫血清識別，且對E94-102更易于識別；重組CsLDH也

14、能被E10-20及E94-102免疫血清識別，而不能被對照血清識別。 3、抗吸蟲藥物對于重組CsLDH作用研究 吡喹酮：吡喹酮對重組的CsLDH催化丙酮酸還原成乳酸(正反應(yīng))以及乳酸氧化成丙酮酸(逆反應(yīng))都存在明顯的抑制作用。藥物濃度在8.0mmol／L時酶催化逆反應(yīng)的活性被抑制了56.81％(P<0.01)；在9.0mmol／L濃度時酶催化正、逆反應(yīng)的活性分別被抑制了94.03％(P<0.01)和94.07％(P<0.

15、01)。 左旋咪唑：左旋咪唑在10mmol／L-120mmol／L范圍內(nèi)，對正反應(yīng)無明顯抑制作用，而對乳酸氧化成丙酮酸的逆反應(yīng)則顯示出明顯的抑制作用，藥物濃度在120mmol／L時，酶活性被抑制91.92％(p<0.01)，增大藥物濃度時依然保持強(qiáng)的抑制作用。阿苯達(dá)唑：不同濃度的阿苯達(dá)唑?qū)χ亟MCsLDH催化的正、逆反應(yīng)都顯示出明顯的抑制作用。同等藥物濃度下，對正、逆反應(yīng)抑制的程度差異不大，在0.20mmol／L時，對酶催化的正、

16、逆反應(yīng)的抑制分別為83.56％(p<0.01)和79.23％(p<0.01)。 芬苯達(dá)唑：芬苯達(dá)唑?qū)φ⒛娣磻?yīng)均有抑制作用，但同等藥物濃度下，對正反應(yīng)的抑制作用要強(qiáng)于逆反應(yīng)。在0.06mmol/L時，對酶催化的正反應(yīng)的抑制作用為47.85％(p<0.01)，而對逆反應(yīng)的抑制為30.39％(p<0.01)。在濃度為0.12mmol／L時，對酶催化的正反應(yīng)抑制為92.2％(<0.01)，而逆反應(yīng)抑制為86.13％(p<0.01)。

17、 研究結(jié)論 1、CsLDH可能是皮層相關(guān)的膜蛋白，定位于皮層表膜；CsLDH催化中心的一個關(guān)鍵殘基位于預(yù)測的膜外線性表位的末端，該表位特異性抗體可能會對酶活性產(chǎn)生影響。多種抗吸蟲藥物主要損傷皮層，CsLDH有可能是其作用靶點(diǎn)。 2、免疫組織化學(xué)顯示CsLDH定位于蟲體的咽部、腸支、表膜、口腹吸盤等能量代謝旺盛的內(nèi)外環(huán)境界面；GFP蛋白示蹤及免疫細(xì)胞化學(xué)證實(shí)CsLDH定位于細(xì)胞膜上，證實(shí)了CsLDH是膜蛋白的預(yù)測。重