重組華支睪吸蟲(chóng)胞漿和線粒體蘋(píng)果酸脫氫酶功能的研究.pdf

1、目的：華支睪吸蟲(chóng)(肝吸蟲(chóng))流行于我國(guó)十多個(gè)省(自治區(qū))，治療藥物主要為吡喹酮和阿苯噠唑。大量的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明，血吸蟲(chóng)、腸道線蟲(chóng)、一些絳蟲(chóng)等已出現(xiàn)了針對(duì)吡喹酮或阿苯噠唑的抗性。雖然目前尚未發(fā)現(xiàn)肝吸蟲(chóng)針對(duì)吡喹酮或阿苯噠唑的抗性問(wèn)題，但提前研究可能的替代性藥物仍有必要。蘋(píng)果酸脫氫酶(EC1.1.1.37)屬于NAD依賴的2-羥基羧酸脫氫酶。絕大多數(shù)真核細(xì)胞內(nèi)具有兩種蘋(píng)果酸脫氫酶：胞漿蘋(píng)果酸脫氫酶(cMDH)和線粒體蘋(píng)果酸脫氫酶(mMDH)。mM

2、DH為三羧酸循環(huán)的重要組成部分，cMDH和mMDH還與天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶一起組成天冬氨酸-蘋(píng)果酸穿梭體，參與轉(zhuǎn)移細(xì)胞內(nèi)還原性平衡物，另外在糖酵解和糖異生等方面也起重要作用。cMDH和mMDH有可能作為藥物或疫苗的靶標(biāo)。蘋(píng)果酸脫氫酶還可用于檢測(cè)生物材料中的CO2、醋酸鹽、乙酰CoA、檸檬酸鹽、谷氨酸-草酰乙酸轉(zhuǎn)移酶、ATP-檸檬酸裂解酶和檸檬酸合成酶等。所以，體外表達(dá)并得到純化的蘋(píng)果酸脫氫酶，并對(duì)其結(jié)構(gòu)和功能進(jìn)行研究，具有一定的價(jià)值。

3、 方法：建立華支睪吸蟲(chóng)成蟲(chóng)cDNA文庫(kù)，進(jìn)行大規(guī)模測(cè)序，通過(guò)各種生物信息學(xué)分析，確定肝吸蟲(chóng)胞漿和線粒體蘋(píng)果酸脫氫酶的cDNA，并以Northernblot鑒定是否為全長(zhǎng)基因。構(gòu)建pQE-30胞漿蘋(píng)果酸脫氫酶基因和pGEX-4T-1線粒體蘋(píng)果酸脫氫酶基因的重組質(zhì)粒，重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染大腸桿菌后，IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，以BDTALONTM金屬離子親和樹(shù)脂和GST融合蛋白親和純化柱分別純化體外表達(dá)的重組肝吸蟲(chóng)胞漿蘋(píng)果酸脫氫酶(Cs-cMDH)和線粒體蘋(píng)