基于絲網(wǎng)印刷技術(shù)的蘋果酸脫氫酶電極設(shè)計(jì).pdf

1、L-蘋果酸是普遍存在于動(dòng)物、植物及微生物體內(nèi)的一種重要羧酸，在細(xì)胞內(nèi)參與多種生命活動(dòng)，在食品、醫(yī)藥以及化工等領(lǐng)域都有重要的應(yīng)用。對(duì)于L-蘋果酸的定量檢測，目前主要包括色譜法、光譜法、酶法等，這些方法雖然能夠滿足測定精確度的要求，但一般步驟繁瑣、成本較高。
　　蘋果酸脫氫酶（MDH）在存在其輔酶NAD(P)+時(shí)可在生理?xiàng)l件下催化蘋果酸的轉(zhuǎn)化及NAD(P)H的生成。利用對(duì)NAD(P)H敏感的電化學(xué)傳感器對(duì)其進(jìn)行檢測，可以實(shí)現(xiàn)對(duì)L-蘋果

2、酸的定性定量分析。根據(jù)這一原理可以通過將蘋果酸脫氫酶固定于NADH敏感電極表面形成電流型酶電極的途徑解決L-蘋果酸的定量檢測問題。
　　本文將蘋果酸脫氫酶同殼聚糖、戊二醛制成固定化酶制劑，并將其整合至由碳納米管修飾的電化學(xué)基底電極表面構(gòu)成酶電極，得到對(duì)L-蘋果酸敏感的酶生物傳感器：
　?。?）利用魚精蛋白（Pr）與多壁碳納米管（CNT）形成穩(wěn)定的復(fù)合物，以此復(fù)合物對(duì)絲網(wǎng)印刷電極（SPE）的工作表面進(jìn)行修飾，獲得碳納米管功能化

3、的絲網(wǎng)印刷電極Pr/CNT/SPE。通過表面微觀結(jié)構(gòu)表征發(fā)現(xiàn)，魚精蛋白的應(yīng)用使碳納米管修飾電極表面形成了穩(wěn)定、致密的微觀結(jié)構(gòu)，顯著提高了修飾電極對(duì) NADH的電催化性能。修飾電極對(duì)NADH在2-1500μmol/L的范圍內(nèi)存在線性響應(yīng)，回歸方程i(μA)=-1.8764c(mmol/L)-0.0516，R2=0.984。響應(yīng)時(shí)間為6 s，靈敏度為1.8764μA·L/mmol/Lol，檢測限為0.05μmol/L(S/N=3)。實(shí)驗(yàn)還確

4、定了最佳的Pr/CNT質(zhì)量分?jǐn)?shù)，確定Pr/CNT質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.5作為制備Pr/CNT/SPE的最佳方案。
　　（2）以Pr/CNT/SPE作為基底電極構(gòu)建對(duì)L-蘋果酸靈敏的電化學(xué)酶電極。以戊二醛（GDI）對(duì)殼聚糖（CHIT）進(jìn)行改性處理，獲得表面保留有自由醛基的酶固定化載體。將MDH同此固定化載體以合適的比例混合可以得到固定化酶CHIT-GDI-MDH。以此固定化酶修飾Pr/CNT/SPE，并以核微孔膜防止固定化酶的泄漏，即得完整

5、的蘋果酸脫氫酶電極CHIT-GDI-MDH/Pr/CNT/SPE。該酶電極對(duì)5-300μmol/L內(nèi)的L-蘋果酸存在線性響應(yīng)，其可用以定量檢測的回歸方程為i(μA)=-0.69c(mmol/L)-0.0024（R2=0.995）。響應(yīng)時(shí)間為6-8 s，檢測靈敏度為0.69μA·L/mmol；檢測限為0.03μmol/L(S/N=3)。實(shí)驗(yàn)還對(duì)酶電極的抗干擾性能進(jìn)行了評(píng)估，發(fā)現(xiàn)酶電極具備一定的抗干擾性能，適合用于實(shí)際樣本中L-蘋果酸的分析

6、檢測。
　　（3）酶電極的制備方法及檢測條件優(yōu)化。選取CHIT-GDI:MDH比例、pH、工作電位以及測試溫度4個(gè)因素作為實(shí)驗(yàn)變量，首先通過單因素實(shí)驗(yàn)分析了其各自對(duì)酶電極傳感性能的影響并確定出其各自的最佳水平。隨后，再以4個(gè)因素進(jìn)行正交試驗(yàn)，進(jìn)一步尋找最優(yōu)方案。結(jié)果顯示，CHIT-GDI-MDH/Pr/CNT/SPE的最佳制備方法及工作條件為：以每30U MDH同100μL CHIT-GDI混合制備CHIT-GDI-MDH，選用p