Thermus Thermophilus HB27蘋果酸脫氫酶基因的克隆表達(dá)、酶抑制動(dòng)力學(xué)及蛋白折疊研究.pdf

1、蘋果酸脫氫酶(Malate dehydrogenase,EC1.1.1.37,MDH)是一種重要的糖代謝酶,在生物體內(nèi)特異性催化L-蘋果酸成為草酰乙酸從而完成三羧酸循環(huán)(TCA)?？衫肕DH底物專一性特征,將其用于拆分DL-蘋果酸以得到重要的手性碳源(D-蘋果酸)。此外,MDH具有同源二聚體分子結(jié)構(gòu),這一結(jié)構(gòu)的特殊性決定了MDH常被用作于寡聚蛋白分子的結(jié)構(gòu)及功能研究的模型分子。鑒于MDH重要的經(jīng)濟(jì)及科研價(jià)值,本研究從嗜熱菌Thermu

2、sthermophilus HB27中克隆獲得Tt-MDH基因,并在大腸桿菌中成功表達(dá),重組蛋白可溶的且具有生物學(xué)活性;建立了簡(jiǎn)單可行的純化流程,獲得了高純度并具熱穩(wěn)定的目的蛋白,并對(duì)其生物化學(xué)性質(zhì)、去折疊和再折疊過程進(jìn)行了詳細(xì)的研究。
　　 以L-蘋果酸和NAD+為底物,研究了不同的pH、溫度和金屬離子對(duì)Tt-MDH活性的影響,結(jié)果顯示其最適pH為11.5,最適溫度為80℃。Mn2+和Ni2+對(duì)Tt-MDH的活性都有激活作用,

3、其激活能力依次下降;而Ca2+,和Cu2+表現(xiàn)出抑制效應(yīng)。結(jié)果表明Tt-MDH可能在幫助Thermus thermophilus HB27適應(yīng)極端溫度和特定的生存環(huán)境方面發(fā)揮著重要的生理作用。
　　 利用此高純度的Tt-MDH,我們進(jìn)行了由鹽酸胍誘導(dǎo)的Tt-MDH抑制動(dòng)力學(xué)的研究,鹽酸胍使Tt-MDH變性是一個(gè)兩相反應(yīng)動(dòng)力學(xué)過程,Tt-MDH的活性顯示了一種時(shí)間依賴的抑制方式,Icso值為為1.45 mol/L。熒光光譜分析結(jié)果

4、表明鹽酸胍通過誘導(dǎo)疏水面的暴露從而改變Tt-MDH高級(jí)結(jié)構(gòu)。對(duì)于Tt-MDH的再折疊過程中osmolytes的防聚沉作用實(shí)驗(yàn)表明:osmolytes的加入會(huì)使胍變性Tt-MDH復(fù)性過程中的聚沉量大大下降,誘導(dǎo)正確的折疊方式。
　　 本研究對(duì)于理解這一新的熱穩(wěn)定性Tt-MDH的耐熱機(jī)制、折疊機(jī)理、結(jié)構(gòu)和功能,并為構(gòu)建高效耐熱的工程菌及其工業(yè)化應(yīng)用提供了一些有用的信息,同時(shí),對(duì)于以Tt-MDH為藥物作用靶標(biāo)研發(fā)其抑制劑類藥物,以期治