大腸桿菌中蘋果酸脫氫酶和絲氨酸乙酰轉(zhuǎn)移酶消去化修飾的鑒定.pdf

1、消去化修飾是近年來發(fā)現(xiàn)的一種新的罕見的蛋白質(zhì)翻譯后修飾，是指通過巰基進攻不飽和氨基酸從而發(fā)生米歇爾共價加成反應(yīng)。目前發(fā)現(xiàn)的消去化修飾蛋白只有三種，晶狀體蛋白、MAPKs和Glutathione peroxidase,而多肽有200多種。對于消去化修飾的鑒定，目前科學界并沒有較好的研究方法，為填補這一空白，發(fā)現(xiàn)更多的具有消去化修飾的蛋白質(zhì)及多肽，我們在本實驗室已經(jīng)成熟的標記探針基礎(chǔ)上對大腸桿菌 BL21(DE3)裂解液進行標記，并鑒定到了

2、221個可能具有消去化修飾的蛋白。選取其中兩個大腸桿菌中鑒定到的可能具有消去化修飾的蛋白，蘋果酸脫氫酶和絲氨酸乙酰轉(zhuǎn)移酶，進行后期條件更加嚴格的鑒定。
　　首先通過構(gòu)建重組菌在大腸桿菌 BL21(DE3)中進行誘導表達,選用 Ni-TED進行親和層析純化得到純度較高的蘋果酸脫氫酶以及絲氨酸乙酰轉(zhuǎn)移酶，利用成熟探針bio-SH試劑對目的蛋白進行初步標記，發(fā)現(xiàn)二者具有較好的Michael加成效果。同時為驗證所使用的化學探針bio-SH

3、試劑的特異性，排除反應(yīng)中可能存在非特異性，選擇在加成反應(yīng)過程中加入已驗證的具有加成效果的DTT試劑進行競爭，發(fā)現(xiàn)蘋果酸脫氫酶和絲氨酸乙酰轉(zhuǎn)移酶Michael加成反應(yīng)有一定程度的減弱，近而說明了化學探針bio-SH試劑具有特異性。
　　其次，將bio-SH試劑進行過化學標記的蛋白與Streptavidin-NHS beads進行室溫孵育，對兩個目的蛋白進行特異性富集純化，為后邊進行質(zhì)譜檢測奠定了基礎(chǔ)。
　　最后，利用CRISP

4、R/Cas9基因編輯技術(shù)對大腸桿菌中蘋果酸脫氫酶進行敲除，隨后通過對其基因缺陷株進行回補以及表達純化。對目的蛋白進行特異性化學標記后，比較過表達蛋白與正常表達蛋白之間加成效率的差異。其中在缺陷株中蛋白過表達后其加成效率要高于大腸桿菌BL21(DE3)中正常表達的蛋白。
　　本課題建立在本實驗室成熟的探針標記基礎(chǔ)上，對大腸桿菌中蘋果酸脫氫酶和絲氨酸乙酰轉(zhuǎn)移酶進行化學標記，在排除非特異性反應(yīng)的條件下對二者進行掛柱效率的檢測，并通過MD