分枝桿菌絲氨酸乙?；D(zhuǎn)移酶的功能與結(jié)構(gòu)研究.pdf

1、由結(jié)核分枝桿菌引起的結(jié)核病仍然是目前危害人類健康的慢性傳染病。由于結(jié)核分枝桿菌的多耐藥性和廣耐藥性，加之與艾滋病毒的互作，使得結(jié)核病的發(fā)病率和死亡率不斷地增加，因此研發(fā)新的抗結(jié)核的藥物迫在眉睫。L-半胱氨酸(L-cys)是重要的含硫氨基酸，參與L-蛋氨酸、二級代謝物、輔酶A等含硫化合物的生物合成。微生物的半胱氨酸合成由絲氨酸經(jīng)過絲氨酸乙?；D(zhuǎn)移酶(SAT/CysE)轉(zhuǎn)化為氧乙酰絲氨酸，再在氧乙酰絲氨酸硫解酶的作用下，最終轉(zhuǎn)化為半胱氨酸。

2、絲氨酸乙?；D(zhuǎn)移酶參與半胱氨酸合成的第一步反應(yīng)，將絲氨酸最終轉(zhuǎn)化為半胱氨酸。這條合成半胱氨酸的途徑僅存在于植物和微生物中，與人體中合成半胱氨酸的途徑完全不同。因此，絲氨酸乙?；D(zhuǎn)移酶是抗結(jié)核分枝桿菌的一個潛在的藥物靶點(diǎn)。
　　 本論文的目的:
　　 (1)確定恥垢分枝桿菌中表達(dá)絲氨酸乙?；D(zhuǎn)移酶的基因，確認(rèn)其絲氨酸乙?；D(zhuǎn)移酶的功能。研究敲除絲氨酸乙?；D(zhuǎn)移酶的基因后對恥垢分枝桿菌的生長及代謝的影響，以確定它的抗結(jié)核藥物

3、靶點(diǎn)的特性，同時尋找更多的潛在的藥物作用的靶點(diǎn)。
　　 (2)通過點(diǎn)突變了解乙?；D(zhuǎn)移酶的空間結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系，確定結(jié)核分枝桿菌的絲氨酸乙酰轉(zhuǎn)移酶活性位點(diǎn)。通過優(yōu)化結(jié)核分枝桿菌的絲氨酸乙?；D(zhuǎn)移酶的表達(dá)及了解酶學(xué)特征，為建立高通量篩選酶抑制劑的模型及定向設(shè)計酶抑制劑提供理論依據(jù)。
　　 本論文的方法和結(jié)果如下:
　　 1.恥垢分枝桿菌基因MSMEG_5947的克隆表達(dá)以及活性測定
　　 PCR擴(kuò)增基因MS

4、MEG_5947，構(gòu)建克隆載體pMD18-MSMEG_5947。DNA序列測定正確后構(gòu)建用于表達(dá)的載體pET16-MSMEG_5947和pCold-MSMEG_5947，將其轉(zhuǎn)化到表達(dá)菌株BL21(DE3)中。SDS-PAGE和蛋白質(zhì)印跡檢測MSMEG_5947蛋白表達(dá)。Ni-NTA-Agarose親和層析柱純化在大腸桿菌中過表達(dá)的目的蛋白。SDS-PAGE和Western blotting檢測到了純化的MSMEG5947蛋白。DTNB

5、(Ellman)法檢測到了表達(dá)的蛋白的絲氨酸乙?；D(zhuǎn)移酶的活性。
　　 2.恥垢分枝桿菌基因MSMEG_5947敲除菌株的構(gòu)建以及基因缺失后的影響
　　 (1) MSMEG_5947基因敲除菌株的構(gòu)建
　　 PCR擴(kuò)增基因MSMEG_5947基因及其上游約696 bp的DNA序列，并將其克隆到pMD18-T上，測序后的序列與恥垢分枝桿菌基因組上MSMEG_5947基因序列完全一致的陽性質(zhì)粒用于下面的實(shí)驗(yàn)。將來自于

6、質(zhì)粒pUC4K的KanR的片段克隆到MSMEG5947基因內(nèi)，產(chǎn)生MSMEG5947::KanR突變基因。將MSMEG_5947::KanR突變基因克隆到質(zhì)粒pPR27-xylE，構(gòu)建了條件性復(fù)制質(zhì)粒pPR27-xylE-MSMEG_5947::KanR。
　　 PCR擴(kuò)增cysE基因，并將其克隆到pMD18-T上，測序正確后將它連接到pET23b質(zhì)粒上，再連同該質(zhì)粒上的啟動子一起連接到質(zhì)粒營救質(zhì)粒pCG76。構(gòu)建了營救質(zhì)粒pC

7、G76-Phsp60-cysE。
　　 將條件復(fù)制性質(zhì)粒pPR27-xylE-MSMEG_5947::KanR電轉(zhuǎn)化到恥垢分枝桿菌中。在42℃條件下迫使 pPR27-xylE-MSMEG_5947::KanR質(zhì)粒中的MSMEG_5947::KanR與恥垢分枝桿菌的基因組中的MSMEG_5947發(fā)生同源重組，MSMEG_5947::KanR以及sacB基因、xylE基因整合到基因組中。Southern印跡和PCR的方法分析篩選出了

8、發(fā)生第一次同源重組的菌株(mc2155MSMEG_5947 SOC-1)。
　　 營救質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到mc2155 MSMEG_5947 SOC-1中，在30℃條件下，用10％蔗糖的壓力選擇培養(yǎng)轉(zhuǎn)化的mc2155 MSMEG5947 SCO-1，在這種選擇壓力下，mc2155 MSMEG_5947 SCO-1基因組中的MSMEG_5947::KanR與MSMEG_5947發(fā)生第二次同源重組，將MSMEG_5947基因、sacB基因以及

9、xylE基因從mc2155MSMEG_5947 SCO-1基因組中刪除掉只留下MSMEG_5947::KanR。用Southern印跡和PCR方法篩選出MSMEG5947基因敲除菌株(SM-△M_5947stain)。
　　 (2) MSMEG_5947基因敲除菌株的生長曲線
　　 MSMEG_5947基因敲除菌株在每間隔24小時測定30℃和42℃條件下的OD600nm的值，繪制敲除菌株的生長曲線。相比于野生型菌株，敲除

10、菌株的生長在30℃的條件下沒有變化。在42℃的條件下，基因敲除菌株的生長相比于野生型的菌株有滯緩。因而說明了MSMEG_5947基因?qū)Ψ种U菌生長有影響。
　　 (3) MSMEG_5947基因敲除菌株的電鏡觀察
　　 用掃描電鏡和透射電鏡觀察MSMEG_5947基因敲除菌株在42℃條件下培養(yǎng)后的形態(tài)的變化。相比于野生型的菌株，敲除菌株的形態(tài)在對數(shù)期發(fā)生了了明顯的變化。菌體末端出現(xiàn)膨大，菌體內(nèi)部出現(xiàn)了大量的空泡。因而MS

11、MEG_5947基因?qū)Ψ种U菌的形態(tài)有影響，
　　 (4) MSMEG_5947基因敲除菌株的蛋白質(zhì)組學(xué)的分析
　　 用雙向電泳分析基因敲除后的菌株相比與正常的菌株的蛋白質(zhì)組學(xué)。利用Image J軟件對斑點(diǎn)進(jìn)行分析匹配，發(fā)現(xiàn)差異的蛋白點(diǎn)。MALDI-TOF質(zhì)譜鑒定，在Matrix Science-Mascot數(shù)據(jù)庫中查找比對，對每個差異點(diǎn)選出匹配度最高的蛋白。對結(jié)核分枝桿菌蛋白相應(yīng)編碼基因進(jìn)行功能學(xué)分類，找到與結(jié)核分枝桿

12、菌代謝有關(guān)的酶。
　　 3.結(jié)核分枝桿菌絲氨酸乙?；D(zhuǎn)移酶同源模型的建立
　　 用一些生物信息學(xué)軟件，例如ProtParam，Inter-ProScan，PSIPRED，NCBI Conserved Domains Database和SWISS-MODEL等分析結(jié)核分枝桿菌絲氨酸乙酰基轉(zhuǎn)移酶的一級結(jié)構(gòu)，二級結(jié)構(gòu)以及空間結(jié)構(gòu)模型。
　　 4.結(jié)核分枝桿菌絲氨酸乙酰基轉(zhuǎn)移酶的表達(dá)，活性測定及動力學(xué)特性的分析
　

13、　 用pCold質(zhì)粒優(yōu)化表達(dá)結(jié)核分枝桿菌的絲氨酸乙?；D(zhuǎn)移酶。HPLC和DTNB(Ellman)法測定絲氨酸乙?；D(zhuǎn)移酶的活性。測定了該酶的最適反應(yīng)條件和酶促動力學(xué)常數(shù)。絲氨酸乙?；D(zhuǎn)移酶的比活度是10.66±0.44μmol/min/mg，最適反應(yīng)溫度是37℃，最適pH是7.5。
　　 5.結(jié)核分枝桿菌乙?；D(zhuǎn)移酶氨基酸定點(diǎn)突變
　　 利用反向PCR及分子克隆技術(shù)構(gòu)建出3種pET29-cysE-M突變重組質(zhì)粒，分別轉(zhuǎn)

14、化到BL21(DE3)中。蛋白質(zhì)印跡分析表明突變蛋白可以表達(dá)，但是表達(dá)量不高。HPLC分析酶活性，突變體都具有絲氨酸乙?；D(zhuǎn)移酶的活性，用DTNB分析酶活性變化，突變體的酶的活性相對于正常的酶的活性都有所降低。
　　 結(jié)論:
　　 1.恥垢分枝桿菌中絲氨酸乙?；D(zhuǎn)移酶的基因確認(rèn)為MSMEG_5947，但是是非必需的基因。
　　 2.絲氨酸乙酰基轉(zhuǎn)移酶的基因敲除后的蛋白質(zhì)有差異。差異的蛋白與分枝桿菌的能量代謝和蛋白

15、的合成有關(guān)。
　　 3.結(jié)核分枝桿菌的絲氨酸乙?；D(zhuǎn)移酶的結(jié)構(gòu)預(yù)測可知，它具有一個保守的左手β螺旋是該酶活性有關(guān)的結(jié)構(gòu)域。
　　 4.絲氨酸乙?；D(zhuǎn)移酶的67位天冬氨酸，82位的組氨酸，117位的組氨酸是與其活性有關(guān)的位點(diǎn)。
　　 未來研究方向:
　　 1.用雙向電泳進(jìn)一步的篩選和鑒定絲氨酸乙?；D(zhuǎn)移酶基因敲除后的差異蛋白;
　　 2.利用Real-Time PCR對恥垢分枝桿菌氨酸乙酰基轉(zhuǎn)移酶基