大腸桿菌K12 GlcNAc-1-P尿苷轉(zhuǎn)移酶的研究.pdf

1、以寡糖和糖復(fù)合物(糖脂、糖蛋白等)形式存在的糖類化合物是發(fā)現(xiàn)于所有生命體的重要生物聚合物，它們在眾多復(fù)雜生物過程中發(fā)揮著不可替代的重要作用。糖鏈結(jié)構(gòu)形式的特定改變與特定的病理狀態(tài)(如癌癥和炎癥)機(jī)密相關(guān)，這顯示了糖鏈在臨床診斷中的應(yīng)用潛力，以及作為藥物開發(fā)靶點(diǎn)的可能性。
　　 自然界中糖鏈的生物合成是由糖基轉(zhuǎn)移酶催化進(jìn)行的，它們將相應(yīng)的糖核苷酸上特定的單糖轉(zhuǎn)移到一個(gè)糖基受體的特定羥基基團(tuán)上，形成糖苷鍵的共價(jià)連接。由于其在高效合成

2、高度空間特異性和立體化學(xué)特異性的糖苷鍵方面展現(xiàn)出的優(yōu)勢，利用糖基轉(zhuǎn)移酶催化糖鏈合成已經(jīng)成為利用有機(jī)化學(xué)手段合成糖鏈的有效替代途徑。有機(jī)合成手段可以為天然化合物提供多樣性的衍生物，為藥物丌發(fā)研究提供更多選擇性靶點(diǎn)。將生物酶法和化學(xué)法結(jié)合的化學(xué)-酶法合成，是近年來廣泛應(yīng)用于糖生物學(xué)研究領(lǐng)域的一個(gè)重要手段，有機(jī)合成和生物酶法優(yōu)勢互補(bǔ),成為目前糖生物學(xué)和糖化學(xué)研究領(lǐng)域的一個(gè)充滿生機(jī)活力的研究方法和手段。
　　 糖核苷酸(nucleoti

3、de sugars)亦稱為活性糖(active sugars)，在化學(xué)結(jié)構(gòu)上是單糖的還原端和核苷一磷酸或二磷酸的末端磷酸基團(tuán)結(jié)合形成的化合物。糖核苷酸的生理意義主要包括:1.通過糖核苷酸之間的相互轉(zhuǎn)化，產(chǎn)生一系列糖基轉(zhuǎn)移酶催化反應(yīng)所必須的活性糖;2.在糖苷和多糖的生物合成過程中，作為糖的供體，是糖單元合成的前體。
　　 UDP-GlcNAc是細(xì)胞內(nèi)的一種重要的氨基糖供體，是細(xì)胞內(nèi)多種細(xì)胞分子合成的前體物質(zhì)。這些細(xì)胞內(nèi)分子主要包括

4、細(xì)胞壁肽聚糖、脂多糖、腸桿菌科細(xì)菌表面共同抗原、幾丁寡糖、GPI錨、糖胺聚糖和糖蛋白等。
　　 生物體內(nèi)UDP-G1cNAc的合成，都以己糖代謝途徑的中間產(chǎn)物果糖-6-磷酸(Fructose-6-P)為起始底物，在多種酶的協(xié)同催化作用下，最終合成UDP-GlcNAc。根據(jù)合成過程中催化反應(yīng)的順序及合成途徑所涉及酶的來源不同，分為真核UDP-GlcNAc合成途徑和原核UDP-G1cNAc合成途徑。兩種合成途徑的主要區(qū)別在于氨基葡萄

5、糖-6-磷酸(GlcN-6-P)的乙?；彤悩?gòu)化反應(yīng)的先后順序不同。真核合成途徑中，G1cN-6-P先在乙酰轉(zhuǎn)移酶的作用下，生成乙酰氨基葡萄糖-6-磷酸(G1cNAc-6-P)，然后再由異構(gòu)酶作用，生成乙酰氨基葡萄糖-1-磷酸(GlcNAc-1-P);而原核合成途徑中，G1cN-6-P先異構(gòu)化為氨基葡萄糖-1-磷酸(G1cN-1-P)，然后再在乙酰轉(zhuǎn)移酶催化下生成G1cNAc-1-P。
　　 本論文以大腸桿菌K12來源的GlmU

6、為研究對(duì)象，對(duì)GlmU和GlmU的N-端結(jié)構(gòu)域GlmU-Tr229的底物廣泛性進(jìn)行了系統(tǒng)研究。除了以揭示它們的底物適應(yīng)性、酶的動(dòng)力學(xué)性質(zhì)和催化機(jī)理為目的的生化研究，本論文還通過體外小量合成反應(yīng)驗(yàn)證了GlmU在氨基糖核苷酸合成中的潛在應(yīng)用價(jià)值;本論文還就GlmU突變體進(jìn)行了初步研究，取得了一定的成果。
　　 論文第二章我們克隆了來自Escherichia coli K12的GlcNAc-1-P尿苷轉(zhuǎn)移酶(GlmU)，IPTG誘導(dǎo)G

7、lmU蛋白在E.coli BL21(DE3)中表達(dá)，帶有N-端His標(biāo)簽的GlmU蛋白經(jīng)過Ni-NTA純化，SDS-PAGE電泳結(jié)果顯示，GlmU純度達(dá)到90％以上，GlmU單體分子的表觀分子量約為50 kDa，與理論推導(dǎo)值基本一致。
　　 論文研究了底物GlcNAc-1-P的C2位化學(xué)修飾對(duì)GlmU催化反應(yīng)的影響。
　　 分別使用了C2位是羥基(Glc)，C2位為乙酰氨基(GlcNAc)和C2位為有疊氮基修飾(GlcN

8、AcZ)的三種不同糖-1-磷酸衍生物。實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，GlmU對(duì)三種糖-1-磷酸有不同的催化活性，以UTP為核苷三磷酸供體的反應(yīng)，使用GlcNAcZ-1-P和Glc-1-P的反應(yīng)得率分別是以GlcNAc-1-P為底物時(shí)反應(yīng)得率的86％和30％。以前的相關(guān)研究表明，GlcNAc-1-P的乙酰氨基與酶分子Thr82和Glu154殘基以氫鍵相互作用。Glc-1-P反應(yīng)轉(zhuǎn)化率的降低進(jìn)一步證明了Thr82和Glu154殘基在糖-1-磷酸識(shí)別中的重要

9、作用。相反，GlcNAcZ-1-P反應(yīng)轉(zhuǎn)化率沒有顯著變化的結(jié)果表明GlmU能夠耐受乙酰氨基上的修飾。
　　 第三章結(jié)合E.coli來源的GlmU已有晶體結(jié)構(gòu)，克隆并構(gòu)建了來自E.coli K12的GlmU的N-端結(jié)構(gòu)域(GlGNAc-1-P尿苷轉(zhuǎn)移酶結(jié)構(gòu)域，GlmU-Tr229)，蛋白表達(dá)水平為55 mg/L。為系統(tǒng)研究GlmU-Tr229對(duì)不同核苷三磷酸的底物耐受性，研究中使用了GlcNAc-1-P做催化反應(yīng)底物，使用了12種

10、不同的核苷三磷酸(NTP)，利用毛細(xì)管電泳檢測NDP-GlcNAc的合成情況。NDP-GlcNAc產(chǎn)率結(jié)果顯示，GlmU-Tr229對(duì)不同核苷三磷酸具有一個(gè)底物耐受順序:UTP＞dUTP＞dTTP＞＞CTP＞dATP/dm6ATP，這結(jié)果表明GlmU對(duì)嘧啶核苷酸的利用程度要優(yōu)于對(duì)嘌呤核苷酸的利用。
　　 GlmU蛋白晶體研究結(jié)果已經(jīng)闡明GlmU N-端催化結(jié)構(gòu)域被兩個(gè)突出結(jié)構(gòu)包圍:第一個(gè)突出結(jié)構(gòu)(Asn3-Val111及His2

11、16-227)，主要參與識(shí)別和結(jié)合UDP-GlcNAc的核苷部分;第二個(gè)突出結(jié)構(gòu)(Glul12-Val215)則主要是與糖核苷酸中的糖結(jié)構(gòu)相互作用有關(guān)。尿嘧啶通過尿嘧啶環(huán)N3與Gln76之間及4位羰基氧與Gln76、Gly81之間形成的氫鍵被識(shí)別和結(jié)合。核苷中的核糖結(jié)構(gòu)，主要是通過核糖2位的OH基團(tuán)與Gly14之間的氫鍵作用。我們對(duì)GlmU-Tr229的研究結(jié)果表明，GlmU N-端催化結(jié)構(gòu)域有非常顯著的底物耐受性，對(duì)核糖2位的修飾(d

12、UTP)或者是對(duì)尿嘧啶環(huán)C5修飾(dTTP)都不會(huì)顯著影響N-端催化結(jié)構(gòu)域的活性。這些結(jié)果表明，核糖2位OH與Gly14之間的氫鍵在底物識(shí)別過程中不是必需的。
　　 為驗(yàn)證利用重組GlmU-Tr229合成UDP-GlcNAc衍生物的應(yīng)用前景，我們在毫克水平上合成了UDP-GlcNAc的兩種衍生物:dUDP-GlcNAc和UDP-GlcNAcZ。并使用mono Q離子交換層析和P2分子篩凝膠對(duì)糖核苷酸產(chǎn)物進(jìn)行分離純化，最終使用ES

13、I-MS和NMR對(duì)得到的dUDP-GlcNAc(5.1 mg，57.6％)和UDP-G1cNAcZ(4.3 mg，44.4％)進(jìn)行了定性分析。
　　 本論文對(duì)GlmU-Tr229生化性質(zhì)進(jìn)行了細(xì)致的研究，闡述了GlmU-Tr229催化反應(yīng)需要依賴金屬離子做輔助因子，GlmU-Tr229對(duì)金屬離子的依賴性為:Co2+＞Mn2+＞Mg2+＞＞Zn2+/Cu2+/Ni2+＞EDTA;在以Mg2+為輔助因子的催化反應(yīng)體系中，5 mM M

14、g2+是最適的金屬離子濃度，研究了pH對(duì)GlmU-Tr229催化活性的影響，GlmU-Tr229最適pH是7.5，pH6.5-8.5范圍內(nèi)都能夠催化反應(yīng)的進(jìn)行。
　　 我們還對(duì)催化反應(yīng)中副產(chǎn)物焦磷酸的反饋抑制作用進(jìn)行了研究，通過在反應(yīng)體系中加入焦磷酸水解酶，將反應(yīng)體系中累積的焦磷酸水解為無機(jī)磷酸根，以UTP和GlcNAc-1-P為底物的催化反應(yīng)，轉(zhuǎn)化率由原來的65％提高到95％。
　　 第四章中，我們利用一種六碳糖激酶(

15、NahK)，以ATP和GlcNAc為底物，體外酶促反應(yīng)合成并分離純化獲得GlcNAc-1-P。探索了一條體外利用NahK合成GlmU反應(yīng)前體物質(zhì)GlcNAc-1-P的新途徑，解決了GlmU酶學(xué)研究底物供給不足的瓶頸。同時(shí)，為深入研究GlmU-Tr229底物特異性，我們對(duì)GlmU-Tr229的Gln76和Gly81氨基酸位點(diǎn)進(jìn)行了定點(diǎn)突變研究，并對(duì)其中一個(gè)突變體Q76E進(jìn)行了酶學(xué)性質(zhì)的研究。通過毛細(xì)管電泳檢測發(fā)現(xiàn)Q76E的突變引起了Glm