脯氨酸含量測定

1、逆境脅迫下植物體脯氨酸含量測定逆境脅迫下植物體脯氨酸含量測定【實驗目的】【實驗目的】1.了解脯氨酸在植物抗逆性決定中的作用。2.掌握脯氨酸提取和測定的方法?！緦嶒炘怼俊緦嶒炘怼?.逆境條件下（干旱、鹽堿、熱、冷害、凍害）植物體內(nèi)脯氨酸含量會顯著增加，并且積累指數(shù)與植物的抗逆性有關(guān)，因此脯氨酸可作為植物抗逆性的一項生化指標。2.測定脯氨酸含量目前一般使用的方法是茚三酮法。酸性條件下茚三酮和脯氨酸反應生成穩(wěn)定的紅色化合物產(chǎn)物在520nm

2、波長下具有最大吸收峰。用磺基水楊酸提取植物樣品時脯氨酸便游離于磺基水楊酸的溶液中然后用酸性茚三酮加熱處理后，溶液即成紅色再用甲苯萃取，則色素全部轉(zhuǎn)移至甲苯中顏色的深淺即表示脯氨酸含量的高低。【實驗材料】【實驗材料】1.材料：小麥幼苗：（1）對照（2）100mM、200mMNaCl處理48h（3）5%、15%PEG6000處理48h2.試劑：3%磺基水楊酸；冰醋酸；甲苯；2.5%酸性茚三酮溶液；脯氨酸母液50μgml3.器材：天平，燒杯，

3、分光光度計，研缽，容量瓶，具塞試管，移液管，膠頭滴管，水浴鍋【實驗內(nèi)容】【實驗內(nèi)容】1.脯氨酸標準曲線的測定（2）分別吸取1ml系列標準濃度的脯氨酸溶液于6個試管中加入1ml水、1ml冰乙酸、2ml2.5％的酸性茚三酮于沸水浴中加熱30min。（3）冷卻后準確加入4ml甲苯振蕩30S靜置片刻使色素全部轉(zhuǎn)至甲苯溶液。（4）輕輕吸取各管上層甲苯溶液至比色杯中以甲苯為空白對照于520nm進行比色。2.樣品的測定（1）稱取不同處理的小麥葉片各0

4、.5g，于2.5ml3%磺基水楊酸試管中，沸水浴中提取10min。（2）吸取1ml上清于另一試管中，加入1ml水、1ml冰乙酸、2ml2.5％的酸性茚三酮，混合液于沸水中顯色30min。（3）冷卻后加入4ml甲苯，搖蕩30S，萃取完全后用吸管輕輕吸取上層紅色甲苯溶液于比色杯中，以甲苯為空白對照，在520nm比色?！緦嶒灲Y(jié)果】【實驗結(jié)果】查標準曲線，得脯氨酸含量c（g）脯氨酸含量（g.g1）＝c(v／a)／w其中V為提取液總體積mla為測

5、定液體積ml；W為樣品質(zhì)量g。1.標準曲線【實驗討論】【實驗討論】1.采用磺基水楊酸提取植物體內(nèi)的游離脯氨酸，不僅大大減小了其他氨基酸的干擾，快速簡便，而且不受樣品狀態(tài)（干或鮮樣）限制。2.實驗中甲苯的作用主要是萃取，以排除其他可能和茚三酮產(chǎn)生顯色反應的物質(zhì)使得測量值偏高。但同時有研究顯示，未經(jīng)甲苯萃取和經(jīng)甲苯萃取后所得的脯氨酸含量值得趨勢是相同的，即應該高的數(shù)值兩種方法都會高，因此，從污染小，經(jīng)濟，簡便的方向考慮，如果不對脯氨酸進行精

6、確的定量，只是用于作為一個植物抗性的生化指標，可以不使用甲苯的萃取。3.實驗中在繪制標準曲線時，所設置的濃度范圍不太合適，因為沒能把樣品的OD520值包含進去。因此標準曲線并不是很可靠。應該將濃度繼續(xù)增加，盡量使樣品測定的OD520值能夠包含進入曲線的濃度范圍內(nèi)，所得結(jié)果才準確。4.從實驗結(jié)果中可以觀察到，隨著脅迫程度的增加，脯氨酸的含量也會顯著增加。因此，可以說明脯氨酸的含量在一定程度上是植物遭受脅迫大小的反映。而通過比較，發(fā)現(xiàn)鹽脅迫

7、比干旱脅迫對小麥造成的影響更大。5.實驗結(jié)果中，經(jīng)過5%PEG6000(輕度干旱脅迫）處理的小麥葉片內(nèi)的脯氨酸含量甚至比對照組的脯氨酸含量還要低(但相差不多）。而其他幾種脅迫均有顯著的使脯氨酸增加的效果，因此，除了操作過程中的一些誤差外，最重要的是輕度干旱可能不會對小麥造成太大的影響，或者其他的代謝機制可以幫助小麥抵抗輕微干旱，脯氨酸增加不明顯。6.脯氨酸是水溶性最大的氨基酸，具有極強的親水性及水合作用。因此干旱時脯氨酸的積累能夠有效地

8、防止脫水。7.脯氨酸是植物在鹽脅迫下的主要滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)之一，它不僅是生物大分子的保護劑和羥基的清除劑，還是植物從脅迫條件恢復正常過程中迅速、有效的氮源、碳源和還原劑。脯氨酸能夠防止質(zhì)膜透性的變化，對質(zhì)膜的完整性有保護作用，原因可能是脯氨酸與膜磷脂及轉(zhuǎn)運蛋白相互作用，以穩(wěn)定其結(jié)構(gòu)。高等植物中脯氨酸的合成有兩種途徑：谷氨酸途徑和鳥氨酸途徑，兩者的主要區(qū)別在于初始底物分別為谷氨酸（Glu）和鳥氨酸（n）。在滲透脅迫和氮素缺乏情況下，谷氨酸途徑

9、是合成脯氨酸的主要來源；而在氮素供應充足的情況下，鳥氨酸途徑占主導地位。脯氨酸合成發(fā)生在細胞質(zhì)中，P5CR(吡咯啉5，羥酸還原酶)和P5CS（吡咯啉5，羥酸氧化酶）是脯氨酸生物合成過程中的兩個重要酶，后者是限速酶。8.除了高鹽和干旱脅迫外，脯氨酸在低溫脅迫時也起到重要作用。脯氨酸的親水性極強，能穩(wěn)定原生質(zhì)膠體及組織內(nèi)的代謝過程，因而能降低冰點，，有防止細胞脫水的作用。另外，脯氨酸的積累與植物的代謝表現(xiàn)出一定的正相關(guān)性，同時能促進酶核細胞

10、膜的滲透調(diào)節(jié)。有些植物中，脯氨酸的質(zhì)量分數(shù)的變化會引起代謝酶的變化；當植物細胞受到逆境脅迫時，脯氨酸通過保護生物大分子的功能結(jié)構(gòu)為生理生化反應提供足夠的自由水和活性物質(zhì)，從而保護植物度過逆境。9.總體來說，脯氨酸的積累對植物體的抗逆性起到了決定性的作用。但脯氨酸與植物抗逆性的關(guān)系并不簡單，在逆境脅迫下，植物抗逆途徑多種多樣，不同植物，不同條件下，不一定通過同一途徑抵抗外界不良環(huán)境。但總之，脯氨酸最終的作用都是通過發(fā)揮滲透調(diào)節(jié)劑的作用來響