姜黃素對匹羅卡品致癇鼠海馬神經(jīng)元保護(hù)作用的研究.pdf

1、目的：癲癇是人類常見的腦損傷性疾病，約有40％的人類癲癇起源于人腦顳葉故稱為顳葉癲癇。顳葉癲癇主要以海馬病變?yōu)橹鳎@可能與海馬結(jié)構(gòu)獨(dú)特的神經(jīng)元環(huán)路及纖維聯(lián)系有關(guān)。這種顳葉癲癇的持續(xù)狀態(tài)會導(dǎo)致神經(jīng)元和星形膠質(zhì)細(xì)胞中谷氨酸濃度的病理性升高，而這種興奮性氨基酸的水平升高會介導(dǎo)和增強(qiáng)氧化應(yīng)激反應(yīng)。在神經(jīng)系統(tǒng)中海馬神經(jīng)元比其它區(qū)域的神經(jīng)元抵抗這種氧化應(yīng)激反應(yīng)損傷的能力要弱得多，因此海馬神經(jīng)元成為顳葉癲癇模型中最敏感的部位，故顳葉癲癇患者常伴有海馬

2、神經(jīng)元的損傷甚至丟失。研究表明癲癇72小時后引起海馬神經(jīng)元的丟失主要以細(xì)胞凋亡為主。姜黃素是一種從姜科植物Curcuma longa的根莖姜黃中提取的一種植物多酚，有抗氧化、抗炎、抗凝、抗腫瘤、抗突變等多方面的藥理作用。有文獻(xiàn)報道對海人酸誘導(dǎo)癲癇的實(shí)驗(yàn)動物提前注射姜黃素，能減輕海人酸誘導(dǎo)癲癇所造成的海馬神經(jīng)元的損傷程度，從而減輕海馬神經(jīng)元的死亡。本實(shí)驗(yàn)的目的是研究姜黃素對匹羅卡品癲癇模型小鼠海馬神經(jīng)元凋亡的影響。 材料與方法：

3、 一、實(shí)驗(yàn)分組 CD-1小鼠，雌雄并用，共32只，體重18-22g，隨機(jī)分為4組，每組8只。 1、第一組為對照組(Ct1)；2、第二組為鋰-匹羅卡品誘導(dǎo)癲癇組(Pil)；3、第三組為提前18小時預(yù)注姜黃素的癲癇組(Cur+Pil)；4、第四組為單純注射姜黃素動物組(Cur)。 二、癲癇行為學(xué)觀察：CD-1小鼠腹腔注射鋰-匹羅卡品誘導(dǎo)癲癇，成模后觀察其行為學(xué)變化，參考Simialowski 6級(0-V)評定

4、法。 三、組織切片的制備：成模鼠于鋰-匹羅卡品誘導(dǎo)癲癇72小時后腹腔注射4％戊巴比妥鈉麻醉動物，然后用蠕動泵經(jīng)左心室灌流，取大腦，部分標(biāo)本置于30％蔗糖液4℃冰箱保存過夜，制備10μm的冰凍切片，部分標(biāo)本常規(guī)制成7μm的石蠟切片。10μm冰凍切片做甲酚紫染色，7μm的石蠟切片做TUNEL染色，凋亡因子Caspase-3和Caspase-9原位雜交的檢測。 四、染色 1、甲酚紫染色法：10μm的冰凍切片采用甲酚紫染

5、色法染色。切片空氣中晾干后常規(guī)染色10分鐘，沖洗后酒精梯度脫水，透明，封固，鏡下觀察。 2、TUNEL染色：TUNEL染色采用試劑盒，嚴(yán)格按照說明書操作，切片經(jīng)常規(guī)脫蠟，胃蛋白酶消化，滴加反應(yīng)液20μl，然后滴加反應(yīng)終止液，抗地高辛過氧化物酶抗體，最后DAB顯色，封片鏡下觀察。 3、凋亡因子的檢測：凋亡因子Caspase-3和Caspase-9的檢測采用試劑盒，按照說明常規(guī)脫蠟至水，滅活內(nèi)源性過氧化物酶，胃蛋白酶消化然后

6、PBS沖洗，經(jīng)過預(yù)雜交，雜交后洗,SABC37℃20分鐘，生物素過氧化物酶室溫30分鐘，沖洗后DAB顯色。 結(jié)果： 一、行為學(xué)觀察結(jié)果 提前18小時注射姜黃素后誘導(dǎo)癲癇的實(shí)驗(yàn)動物組(Cur+Pil)和癲癇動物組(Pil)動物在誘導(dǎo)癲癇72小時后，均出現(xiàn)典型的癲癇大發(fā)作Ⅳ級-Ⅴ級不等并有部分動物出現(xiàn)癲癇持續(xù)狀態(tài)甚至自發(fā)性癲癇，而在對照組(Ctl)和單純注射姜黃素組(Cur)沒有發(fā)生癲癇。 二、姜黃素對癲癇動

7、物海馬神經(jīng)元的保護(hù)作用 1、甲酚紫染色檢測：姜黃素對癲癇動物海馬神經(jīng)元的保護(hù)作用在甲酚紫染色的切片上，匹羅卡品致癇組(Pil)動物在誘導(dǎo)癲癇72小時后海馬的CA1區(qū)和CA3區(qū)出現(xiàn)明顯的錐體神經(jīng)元死亡，而經(jīng)過提前18小時預(yù)注姜黃素的癲癇組(Cur+Pil)動物在誘導(dǎo)癲癇72小時后海馬錐體神經(jīng)元死亡數(shù)目減少，提示姜黃素對海馬神經(jīng)元有明顯的保護(hù)作用，有效的抑制了海馬神經(jīng)元的死亡。 2、TUNEL染色檢測：姜黃素對癲癇動物海馬神

8、經(jīng)元的保護(hù)作用TUNEL染色的結(jié)果與甲酚紫染色結(jié)果趨勢基本一致，有大量的TUNEL陽性細(xì)胞出現(xiàn)在匹羅卡品致癇組(Pil)動物的海馬CA1區(qū)和CA3區(qū)，而經(jīng)過提前18小時預(yù)注姜黃素的癲癇組動物(Cur+Pil)的海馬神經(jīng)元中TUNEL陽性細(xì)胞明顯減少，表明姜黃素可以使癲癇鼠的海馬神經(jīng)元凋亡數(shù)目減少，起到了對神經(jīng)元的保護(hù)作用。 3、凋亡因子檢測：姜黃素對癲癇動物海馬神經(jīng)元的保護(hù)作用用原位雜交技術(shù)分析凋亡因子Caspase-3和Cas

9、pase-9在各組動物海馬神經(jīng)元的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)在匹羅卡品致癇組(Pil)動物的海馬CA1區(qū)和CA3區(qū)中Caspase-3和Caspase-9陽性細(xì)胞明顯增多，而在經(jīng)過姜黃素注射的癲癇組(Cur+Pil)動物海馬神經(jīng)元中陽性細(xì)胞減少，從凋亡因子的角度說明姜黃素能有效的抑制凋亡因子和凋亡的產(chǎn)生，揭示了姜黃素抑制凋亡產(chǎn)生的途徑。 討論 動物實(shí)驗(yàn)表明頻繁癲癇發(fā)作可導(dǎo)致腦神經(jīng)元的選擇性損傷和丟失，反復(fù)癇性發(fā)作72小時后可造成腦組織缺

10、血、缺氧，使活性氧自由基、NO等大量產(chǎn)生，其所誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡從生物化學(xué)和形態(tài)學(xué)上都具有細(xì)胞凋亡的特征，因此推測細(xì)胞凋亡是癲癇患者大腦神經(jīng)元死亡的一種重要方式。癲癇最常見的受損神經(jīng)元是海馬CA1和CA3區(qū)的錐體細(xì)胞。已知的細(xì)胞凋亡有兩條途徑：一是TNF受體家族成員參與的通過caspase-8活化的外源性凋亡途徑；二是細(xì)胞色素C參與的通過caspase-9活化的內(nèi)源性凋亡。兩條途徑最后均通過激活下游的效應(yīng)因子caspase-3，7誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)

11、生凋亡。從本研究的結(jié)果可以看出在匹羅卡品誘導(dǎo)癲癇組動物的海馬中，甲酚紫染色的CA1區(qū)和CA3區(qū)的存活細(xì)胞較少，證明了癲癇可以導(dǎo)致細(xì)胞的丟失或死亡，而為了進(jìn)一步證明這種癲癇72小時后的細(xì)胞丟失或死亡屬于凋亡，我們做了TUNEL檢測,證實(shí)了癲癇72小時后的細(xì)胞丟失或死亡屬于細(xì)胞凋亡。在進(jìn)一步的試驗(yàn)中，為了探討這種凋亡產(chǎn)生的途徑，我們檢測了凋亡因子caspase-3，9，結(jié)果表明癲癇組動物的海馬CA1區(qū)和CA3區(qū)凋亡因子陽性反應(yīng)細(xì)胞較明顯數(shù)量

12、較多，進(jìn)一步提示了這種癲癇引起的變化可能是一種內(nèi)源性途徑的細(xì)胞凋亡。 姜黃素具有抗氧化、抗炎、抗凝、抗腫瘤、抗突變等多方面的藥理作用，我們對癲癇組動物預(yù)注姜黃素，并比較分析了TUNEL的檢測及內(nèi)源性凋亡途徑中caspase-3和caspase-9凋亡因子的檢測結(jié)果，發(fā)現(xiàn)在預(yù)注姜黃素后誘導(dǎo)癲癇組的動物海馬中其存活細(xì)胞數(shù)目增多，并且凋亡因子caspase-3和caspase-9中的陽性細(xì)胞數(shù)目比癲癇組有所減少，證明姜黃素對內(nèi)源性凋亡

13、途徑起到了抑制的作用，有效的抑制了凋亡的發(fā)生，對癲癇所致的海馬神經(jīng)元死亡及丟失起到了保護(hù)作用。本研究為姜黃素對癲癇的預(yù)防和治療提供了形態(tài)學(xué)依據(jù)。 結(jié)論： 本研究通過腹腔注射姜黃素的方式采用TUNEL技術(shù)、原位雜交等實(shí)驗(yàn)技術(shù)觀察了給于不同處理因素的CD-1小鼠腦內(nèi)海馬神經(jīng)元的變化及其之間的相互關(guān)系，提示： 1、小鼠在腹腔注射匹羅卡品后不但其行為學(xué)發(fā)生變化而且在甲酚紫和TUNEL染色中動物的海馬的CA1區(qū)和CA3區(qū)出