分枝桿菌種間及種內(nèi)不同株之間16S rRNA基因和16S-23S rRNA ITS序列分析.pdf

1、目的：1.建立鑒定分枝桿菌不同種及種內(nèi)不同株的16S rRNA基因和16S-23SrRNA ITS序列分析方法，進(jìn)一步了解16S rRNA基因和16S-23S rRNA ITS在菌種和菌株鑒定中的應(yīng)用價(jià)值，了解其能鑒定的分枝桿菌種類和數(shù)量。2.掌握123種共213株分枝桿菌參考菌株的16S rRNA基因5′端和16S-23S rRNA ITS序列，補(bǔ)充基因數(shù)據(jù)庫的不足。 方法：1.根據(jù)分枝桿菌16S rRNA基因和16S-23S

2、 rRNA ITS序列屬特異性保守區(qū)設(shè)計(jì)引物，對(duì)123種(共213株)分枝桿菌的16S rRNA基因5′端和16S-23S rRNA ITS序列分別進(jìn)行PCR擴(kuò)增、序列測定，用Clustalx 1.83軟件對(duì)不同種及種內(nèi)不同株分枝桿菌的16S rRNA基因5′和16S-23S rRNA ITS分別進(jìn)行同源性多序列比對(duì)，并用鄰位相連法(Neighbour Joining，N-J法)繪制聚類分析樹狀譜，使用DNA STAR的MegAlign

3、軟件計(jì)算種間及種內(nèi)不同株之間的相似性百分比。 結(jié)果： 1.完成119種共包括209株分枝桿菌的16S rRNA基因測序工作，完成123種共包括213株分枝桿菌的16S-23S rRNA ITS測序工作。 2.在做種間分析時(shí)發(fā)現(xiàn)3株鳥分枝桿菌復(fù)合群成員的16S rRNA基因序列、16S-23SrRNAITS分別完全相同；5株結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群成員的16S rRNA基因、16S-23S rRNAITS分別完全相同；海

4、分枝桿菌與潰瘍分枝桿菌16S rRNA基因、16S-23S rRNA分別完全相同；兩種靶基因均不能將以上分枝桿菌相互鑒別。 16S rRNA基因不能鑒別的還有結(jié)核分枝桿菌95052(ATCC35810)與其他5株結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群成員；胃分枝桿菌與堪薩斯分枝桿菌；產(chǎn)鼻疽分枝桿菌與塞內(nèi)加爾分枝桿菌：龜分枝桿菌與膿腫分枝桿菌；豬分枝桿菌與M.boenickei；母牛分枝桿菌(95050)與南非分枝桿菌；M.peregrinum與M.

5、septicum：M.vanbaalenii與母牛分枝桿菌(95051)；M.frederiksbergense與淺黃分枝桿菌：M.murale與東海分枝桿菌；但16S-23S rRNA ITS可以將以上分枝桿菌相互鑒別。 16S-23S rRNAITS不能鑒別的還有副結(jié)核分枝桿菌與鳥分枝桿菌復(fù)合群；千田分枝桿菌、田野分枝桿菌與5個(gè)結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群成員；金色分枝桿菌與東海分枝桿菌；抗熱分枝桿菌與副偶然分枝桿菌；M.vanbaa

6、lenii與南非分枝桿菌；微黃分枝桿菌與灰塵分枝桿菌；奧布分枝桿菌與母牛分枝桿菌；杜氏分枝桿菌與豬分枝桿菌；M.hassiacum與M.pyrenivorans：但16S rRNA基因可以將以上分枝桿菌相互鑒別。 3.在對(duì)其中7種包括97株分枝桿菌進(jìn)行種內(nèi)不同株序列分析時(shí)發(fā)現(xiàn)16S rRNA基因可將13株草分枝桿菌分為3個(gè)基因型，18株偶發(fā)分枝桿菌分為6個(gè)基因型，17株恥垢分枝桿菌分為4個(gè)基因型，8株戈登分枝桿菌分為3個(gè)基因型，

7、9株龜分枝桿菌龜亞種分為3個(gè)基因型，15株堪薩斯分枝桿菌分為2個(gè)基因型，17株產(chǎn)鼻疽分枝桿菌分為1個(gè)基因型；而16S-23S rRNA可依次將上述分枝桿菌分為3個(gè)，15個(gè)，7個(gè)，3個(gè)，4個(gè)，3個(gè)，5個(gè)基因型。 結(jié)論 1.16S rRNA基因和16S-23S rRNA ITS序列分析是分枝桿菌菌種鑒定的良好方法，兩種方法結(jié)合可在很短時(shí)間內(nèi)將除鳥分枝桿菌復(fù)合群、結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群、海分枝桿菌與潰瘍分枝桿菌之外的大部分(123種中的1

8、13種)分枝桿菌鑒定到種。2.16S-23S rRNA ITS的種內(nèi)多態(tài)性較16S rRNA基因強(qiáng)，不僅能鑒別16S rRNA.基因能鑒別的菌株，還能鑒別16S rRNA基因無法鑒別的菌株。與16S rRNA基因相比16S-23SrRNA ITS更適合種內(nèi)不同株的分型和鑒定。3.所有菌株的基因序列均可做為臨床上分枝桿菌鑒定的標(biāo)準(zhǔn)參考序列，補(bǔ)充了基因數(shù)據(jù)庫的不足，為下一步分枝桿菌菌種鑒定探針的設(shè)計(jì)、基因芯片的研究打下良好基礎(chǔ)，并為分枝桿菌