用16s rrna基因?qū)欧N蟹系統(tǒng)學(xué)分析【開題報告+文獻(xiàn)綜述+畢業(yè)設(shè)計】

1、<p><b>　　本科畢業(yè)論文系列</b></p><p><b>　　開題報告</b></p><p><b>　　海洋生物資源與環(huán)境</b></p><p>　　用16S rRNA基因?qū)欧N蟹系統(tǒng)學(xué)分析</p><p>　　一、選題的背景與意義</p>

2、;<p>　　蟹是十足目（Decapoda）短尾次目的甲殼動物，尤指短尾族（Brachyura）的種類（真蟹），也包括其他一些類型，如歪尾族（Anomura）的種類。常見的有關(guān)公蟹、梭子蟹、溪蟹、招潮蟹、絨螯蟹等屬，總共約4500種，見于所有海洋、淡水及陸地。通常以步行或爬行的方式移動。蟹類通常為雜食性，多食腐，有些能與其他動物共生。蟹類中可供使用的主要有三疣梭子蟹、遠(yuǎn)海梭子蟹、青蟹和中華絨螯蟹等，具有較高的營養(yǎng)價值。蟹殼

3、可用以提煉工業(yè)原料甲殼素，也可提制葡糖胺。有些蟹類可作中藥用。蟹幼體或成體可作飼餌或飼料。所以蟹類具有很好的經(jīng)濟(jì)價值和市場開發(fā)力。</p><p>　　幾乎所有蟹類的幼體剛從卵中孵出時外形與成體完全不同。幼體成為水蚤狀幼蟲，體微小，同名，圓形，無肢體，在海面上游泳。脫皮幾次后體型開始增大，成為大眼幼體，這時身體及肢體才更像蟹，再脫皮一次外形方似成體。所以在蟹幼體時，肉眼很難辨別其種類，但很久以來，關(guān)于海洋動物的分

4、類及系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系研究仍局限于對其形態(tài)學(xué)和細(xì)胞學(xué)方法。由于形態(tài)學(xué)和細(xì)胞學(xué)特征往往是基因表達(dá)的結(jié)果，可比較的分類信息較少且易受到環(huán)境等多種因素影響，所以關(guān)于包括蟹在內(nèi)的許多水生動物的分類及系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系一直是困擾人們的難題。自20世紀(jì)60年代以來，蛋白質(zhì)和DNA等信息大分子被廣泛應(yīng)用于生物系統(tǒng)學(xué)研究，克服了在利用形態(tài)學(xué)和細(xì)胞學(xué)方法對海洋動物做分類和系統(tǒng)進(jìn)化研究時的諸多缺點，消除了很多海洋動物分類和系統(tǒng)進(jìn)化研究中的爭議，極大地促進(jìn)了海洋動物分子

5、系統(tǒng)學(xué)的發(fā)展。DNA分子作為遺傳信息的直接載體，不受環(huán)境、生物發(fā)育階段及器官組織的影響，因而能較為準(zhǔn)確地反映出各個物種間的系統(tǒng)發(fā)生關(guān)系。而在這其中，線粒體DNA（mtDNA）的優(yōu)勢又更加明顯。其具有母系遺傳、變異大、無組織特異性等優(yōu)點，且檢測方便，因而在動物的分類、遺傳變異分析和系統(tǒng)進(jìn)化等領(lǐng)域應(yīng)</p><p>　　截止到目前為止，國內(nèi)外報道的利用C0I和16S rRNA基因?qū)ι镒鱿到y(tǒng)學(xué)分析的文章數(shù)量很多，但是

6、所用的實驗材料也是涉及了多個種類的生物，其范圍很廣，另外，同時結(jié)合C0I和16S rRNA基因研究方法的文章也不多，大部分是針對其中一種方法的研究。比如，有基于16S rRNA基因序列多樣性利用指紋方法構(gòu)建微生物的分類和識別系統(tǒng)（1999 ，Raghava G P S，Solanki R，Soni V et al）；利用對蝦屬線粒體DNA基因序列構(gòu)建其系統(tǒng)發(fā)生關(guān)系和演化史（2001，Shane Lavery，T Y Chan，Y K T

7、am, et al）；利用C0I和16S rRNA基因?qū)ι蓉惖倪z傳變異的研究（2005，Perez Farfante I ,Kensley）；比較COI和SSUrDNA序列分析原生動物的多樣性以及其在系統(tǒng)生物學(xué)上的關(guān)系（2010，Thierry J.Heger, Jan Pawlowski, Enrique Lara et al）。</p><p>　　國內(nèi)的相關(guān)研究成果也有很多，其實驗對象涵蓋了脊椎和無脊椎動物

8、的大部分種類，從原生動物到哺乳動物均有見報，但是作蟹類的系統(tǒng)學(xué)分析較為少見，也有一些用蟹做的研究，但都局限于某一種屬的蟹類之間的比較。如，吉鵬宇等做了六種青蟹群體的線粒體16S rRNA和COI基因部分序列差異的研究（2008）；有對三疣梭子蟹線粒體DNA16SrRNA和COI基因片段序列的比較研究（郭天慧，孔曉瑜，陳四清等，2004）；相手蟹屬兩種蟹類線粒體16SrRNA基因序列的比較（徐敬明，張俊麗，方華華等，2006）等等諸如此類

9、的分析報道。</p><p>　　迄今為止，對不同種類的蟹進(jìn)行分子生物學(xué)方法的系統(tǒng)發(fā)育分析還不多見，本實驗采用的實驗材料就包括了不同種類的蟹，相信可以給日后的蟹種間的差異分析提供一些參考數(shù)據(jù)和理論依據(jù)。</p><p>　　二、研究的基本內(nèi)容與擬解決的主要問題：</p><p>　　（一）研究的基本內(nèi)容</p><p>　　1.實驗樣品——幾

10、種蟹類的采集和購買；</p><p>　　2.對樣品進(jìn)行一系列分子生物學(xué)處理，主要包括線粒體DNA的提取、PCR擴(kuò)增和產(chǎn)物純化、測序、數(shù)據(jù)分析以及系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建；</p><p>　　3.得出最終結(jié)論，形成論文。</p><p>　　（二）擬解決的主要問題</p><p>　　通過對幾種蟹類的線粒體基因（COI基因）和16S rRNA的序列

11、等相關(guān)問題的研究，并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，從而弄清這幾種蟹類的在系統(tǒng)發(fā)育上的關(guān)系，進(jìn)一步實踐分子生物學(xué)手段在生物種類鑒別和系統(tǒng)發(fā)育研究上的優(yōu)勢。</p><p>　　三、研究的方法與技術(shù)路線：</p><p><b>　　（一）研究方法</b></p><p><b>　　1.形態(tài)學(xué)辨別：</b></p><

12、p>　　將采集來的蟹類樣品做形態(tài)學(xué)上的初步判別種類為下一步的分子生物學(xué)處理和判斷做輔助準(zhǔn)備；</p><p>　　2.分子生物學(xué)方法研究：</p><p>　　首先對樣品進(jìn)行取樣，然后用酚抽提法提取基因組DNA，然后在PCR反應(yīng)體系中擴(kuò)增基因片段，接著利用純化試劑盒將擴(kuò)增產(chǎn)物純化，再將產(chǎn)物進(jìn)行序列測定，得到的數(shù)據(jù)經(jīng)過分析后進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建和遺傳距離的計算等工作，最后總結(jié)得出結(jié)論。

13、</p><p><b>　?。ǘ┘夹g(shù)路線</b></p><p>　　四、研究的總體安排與進(jìn)度：</p><p>　　2010.9-2010.12 畢業(yè)論文選題</p><p>　　2010.12-2011.1撰寫文獻(xiàn)綜述和開題報告，進(jìn)行開題答辯，進(jìn)行文獻(xiàn)查閱和資料收集，制定具體研究計劃和實施方案，實驗器材的準(zhǔn)備及熟

14、悉基本的實驗操作</p><p>　　2011.1-2011.3 具體進(jìn)行實驗</p><p>　　2011.3-2011.4 數(shù)據(jù)和材料的整理分析，得出結(jié)論，完成畢業(yè)論文</p><p>　　2011.4-2011.5 論文提交并答辯</p><p><b>　　五、主要參考文獻(xiàn)：</b></p><

15、;p>　　[1] 陳麗梅, 孔曉瑜, 喻子牛, 等. 3種蟶類線粒體16SrRNA和C0I基因片段的序列比較及其系統(tǒng)學(xué)初步研究[A]. 海洋科學(xué), 2005,29(8):27-32</p><p>　　[2] 陳子安, 杜曉東, 王慶恒, 等. 3種星蟲線粒體16SrRNA、C0I和Cytb基因片段的序列比較[A]. 廣東海洋大學(xué)學(xué)報, 2007,27(4):3-10</p><p>

16、;　　[3] 陳麗梅, 李琪, 李赟. 4種海參16SrRNA和C0I基因片段序列比較及系統(tǒng)學(xué)研究[A]. 中國水產(chǎn)科學(xué), 2008,15(6):935-942</p><p>　　[4] 畢相東, 楊雷, 侯俊利, 等. C0I基因在海洋動物分子系統(tǒng)學(xué)研究中的應(yīng)用[C]. 水產(chǎn)科學(xué), 2008,27(2):105-108</p><p>　　[5] 孫紅英, 周開亞, 楊小軍. 從線粒體

17、16SrRNA序列探討絨螯蟹類的系統(tǒng)發(fā)生關(guān)系. 動物學(xué)報, 2003,49(5):592-599</p><p>　　[6] 雷忻,廉振民,雷富民,等.基于線粒體C0I基因探討鹟亞科部分屬和種的分類地位[A]. 動物學(xué)研究, 2007,28(3):291-296</p><p>　　[7] 孔曉瑜,姜艷艷,相建海,等.魁蚶線粒體16SrRNA和C0I基因片段序列測定及其應(yīng)用前景. 海洋科學(xué)

18、, 2001,25(12):46-48</p><p>　　[8] 吉鵬宇,沈琪,唐小林,等.六個青蟹群體的線粒體16SrRNA和C0I基因部分序列差異[A]. 海洋湖沼通報, 2008,69-77</p><p>　　[9] 鄭文娟,朱世華,沈錫權(quán),等.泥蚶線粒體16SrRNA和C0I基因片段序列研究[A]. 寧波大學(xué)學(xué)報（理工版）, 2008,21(1):39-42</p>

19、<p>　　[10] 郭天慧,孔曉瑜,陳四清,等.三疣梭子蟹線粒體DNA16SrRNA和C0I基因片段序列的比較研究[A]. 中國海洋大學(xué)學(xué)報, 2004,34(1):22-28</p><p>　　[11] 李莉好,喻達(dá)輝,黃佳菊,等.三種海豚線粒體C0I基因的序列分析[J]. 動物學(xué)雜志, 2007,42(3):20-27</p><p>　　[12] 邱高峰,徐巧婷,王

20、麗卿,等.四種絨螯蟹分子分類與系統(tǒng)發(fā)育[J].動物學(xué)報, 2001,47(6):640-647</p><p>　　[13] 潘寶平,吳琪,張素萍,等.文蛤?qū)?6SrRNA基因及ITS1序列的系統(tǒng)學(xué)分析. 海洋與湖沼, 2006,37(4):342-347</p><p>　　[14] 徐敬明,張俊麗,方華華,等.相手蟹屬兩種蟹類線粒體16SrRNA基因序列的比較[A]. 水產(chǎn)科學(xué), 20

21、06,25(9):443-447</p><p>　　[15] 徐琰,宋林生,李新正.用16SrDNA序列初步探討部分真蝦類的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系[A]. 海洋科學(xué), 2005,29(9):36-41</p><p>　　[16] 孫紅英,周開亞,陸健健,等.中國大陸絨螯蟹線粒體16SrDNA序列變異與分子鑒定標(biāo)記. 自然科學(xué)進(jìn)展, 2002,12(5):485-490</p>&l

22、t;p>　　[17] 馬凌波,張鳳英,喬振國,等.中國東南沿海青蟹線粒體C0I基因部分序列分析[A]. 水產(chǎn)學(xué)報, 2006,30(4):463-468</p><p>　　[18] 麥維軍,謝珍玉,張呂平,等.中國明對蝦與5種蝦類線粒體16SrRNA和C0I基因片段的序列比較及其系統(tǒng)學(xué)初步研究[A]. 海南大學(xué)學(xué)報自然科學(xué)版, 2009,27(1):15-23</p><p>　　

23、[19] 郭奕慧,喻達(dá)輝,黃佳菊,等.中國主要養(yǎng)殖羅非魚親緣關(guān)系的C0I序列分析[A]. 華中農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報, 2009,28(1):75-79</p><p>　　[20] 孔曉瑜,喻子牛,劉亞軍,等.中華絨螯蟹與日本絨螯蟹線粒體C0I基因片段的序列比較研究. 青島海洋大學(xué)學(xué)報, 2001,31(6):861-866</p><p>　　[21] Thierry J.Heger, Jan

24、Pawlowski, Enrique Lara, et al.Comparing potential C0I and SSUrDNA Barcodes for Assessing the Diversity and Phylogenetic Relationships of Cyphoderiid Testate Amoebae.Article In Press,2010,3-12</p><p>　　[22]

25、ZHANG Qing-yi,CHENG Qi-qun,GUAN Wei-bing.Mitochondrial C0I Gene Sequence Variation and Taxonomic Status of Three Macrobrachium Species. Zoological Research 2009,30(6):613-619</p><p>　　[23] LUO Jiacong, XIAO

26、Yongshuang, SONG Lin, et al.Phylogenetic separation of lancelets in China revealed by mitochondrial C0I and Cytb gene analysis. South China Fisheries Science,2007,3(2):8-14</p><p>　　[24] Bucklin A, Guarnieri

27、M, HillRS, et al.Taxonomic and systematic assessment of planktonic copepoda using mitochondrial C0I sequence vatiation and competitive,species-specific PCR[J]. Hydrobiologia,1999(401):239-254</p><p>　　[25] M

28、onicaM, EmestoW, AlinaMS. Examination of the montastraea annularis species complex using IFS and C0I sequences[J].MarBiotechnol,1999(1):89-97</p><p><b>　　畢業(yè)論文文獻(xiàn)綜述</b></p><p><b>

29、;　　海洋生物資源與環(huán)境</b></p><p>　　用C0I和16S基因?qū)π奉愊到y(tǒng)學(xué)分析的綜述研究</p><p>　　摘要：蟹類是水產(chǎn)養(yǎng)殖中的重要經(jīng)濟(jì)物種，分布廣泛，咸淡水中都有很高的物種豐度，具有一定的經(jīng)濟(jì)價值。但由于從形態(tài)學(xué)和細(xì)胞學(xué)上對其分類有一定的難度，所以利用分子生物學(xué)手段鑒定其種類，研究其系統(tǒng)發(fā)育情況已經(jīng)成為主流。本文將重點探討國內(nèi)外研究人員利用C0I和16S基因

30、對生物（尤其是蟹類）進(jìn)行系統(tǒng)學(xué)分析的發(fā)展情況。</p><p>　　關(guān)鍵詞：蟹類；生物學(xué)特性；C0I和16S基因；系統(tǒng)學(xué)分析</p><p>　　很久以來，關(guān)于海洋動物的分類及系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系研究仍局限于對其形態(tài)學(xué)和細(xì)胞學(xué)方法。由于形態(tài)學(xué)和細(xì)胞學(xué)特征往往是基因表達(dá)的結(jié)果，可比較的分類信息較少且易受到環(huán)境等多種因素影響，所以關(guān)于包括蟹在內(nèi)的許多水生動物的分類及系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系一直是困擾人們的難題。自

31、20世紀(jì)60年代以來，蛋白質(zhì)和DNA等信息大分子被廣泛應(yīng)用于生物系統(tǒng)學(xué)研究，克服了在利用形態(tài)學(xué)和細(xì)胞學(xué)方法對海洋動物做分類和系統(tǒng)進(jìn)化研究時的諸多缺點，消除了很多海洋動物分類和系統(tǒng)進(jìn)化研究中的爭議，極大地促進(jìn)了海洋動物分子系統(tǒng)學(xué)的發(fā)展。蟹類作為重要的水產(chǎn)養(yǎng)殖物種，一直以來也是廣大科研工作者重點研究的對象。本文將從多角度解析利用分子生物學(xué)手段（主要是利用C0I和16S基因）對生物進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育學(xué)的研究進(jìn)展，并簡要闡述該研究的發(fā)展動向和趨勢，以

32、及存在的一些問題。</p><p><b>　　1.蟹類生物學(xué)特性</b></p><p><b>　　1.1簡介</b></p><p>　　蟹是十足目（Decapoda）短尾次目的甲殼動物，尤指短尾族（Brachyura）的種類（真蟹），也包括其他一些類型，如歪尾族（Anomura）的種類。常見的有關(guān)公蟹、梭子蟹、溪蟹

33、、招潮蟹、絨螯蟹等屬，總共約4500種，見于所有海洋、淡水及陸地。通常以步行或爬行的方式移動。蟹類通常為雜食性，多食腐，有些能與其他動物共生。</p><p><b>　　1.2分布范圍</b></p><p>　　大部分蟹類生活于海中，甚至熱帶國家數(shù)量豐富的陸蟹，也不時到海里活動，其生命的早期也在海中度過。世界大部分溫暖地區(qū)都有豐富的淡水蟹資源，例如南歐長于河水中的

34、春蟹（Potamon fluviatile）。蛙蟹科、饅頭蟹科、玉蟹科、梭子蟹科、扇蟹科主要生活在沿岸帶；方蟹科、沙蟹科生活在廣闊的潮間帶。極少數(shù)如漂泊蟹和弓腿蟹能附著在木材或其他漂浮物上生活。也有不少種類與其他動物營共棲生活，如綿蟹科，關(guān)公蟹科。許多種如豆蟹常潛入一些軟體動物的外套腔中、或多毛類的管道中共棲。一小部分蟹類完全在淡水中生長繁殖，它們多棲息于山區(qū)溪流的石塊下。還有少數(shù)蟹類如地蟹能適應(yīng)陸地生活，穴居于潮濕的泥洞中，繁殖時期則

35、遷移下海。</p><p><b>　　1.3形態(tài)特征</b></p><p>　　蟹的身體分為頭胸部與腹部。頭胸部的背面覆以頭胸甲，形狀因種不同而不一樣。額部中央具第1、2對觸角，外側(cè)是有柄的復(fù)眼?？谄靼?對大顎，2對小顎和3對顎足。頭胸甲兩側(cè)有5對胸足。腹部退化，扁平，曲折在頭胸部的腹面。雄性腹部窄長，多呈三角形，只有前兩對赴肢變形為交接器；雌性腹部寬闊，第2-

36、5節(jié)各具1對雙枝型附肢，密布剛毛，用以抱卵。</p><p><b>　　1.4經(jīng)濟(jì)價值</b></p><p>　　蟹類中可供使用的主要有三疣梭子蟹、遠(yuǎn)海梭子蟹、青蟹和中華絨螯蟹等，具有較高的營養(yǎng)價值。蟹殼可用以提煉工業(yè)原料甲殼素，也可提制葡糖胺。有些蟹類可作中藥用。蟹幼體或成體可作飼餌或飼料。所以蟹類具有很好的經(jīng)濟(jì)價值和市場開發(fā)力。</p><

37、p>　　2. C0I和16S基因在生物分子系統(tǒng)學(xué)研究中的應(yīng)用</p><p>　　DNA分子作為遺傳信息的直接載體，不受環(huán)境、生物發(fā)育階段及器官組織的影響，因而能較為準(zhǔn)確地反映出各個物種間的系統(tǒng)發(fā)生關(guān)系。而在這其中，線粒體DNA（mtDNA）的優(yōu)勢又更加明顯。其具有母系遺傳、變異大、無組織特異性等優(yōu)點，且檢測方便，因而在動物的分類、遺傳變異分析和系統(tǒng)進(jìn)化等領(lǐng)域應(yīng)用廣泛。其中尤以編碼線粒體細(xì)胞色素C氧化酶亞基

38、1（Cytochromec Oxidase subunit I，簡稱COI）和16S rRNA基因在動物分子系統(tǒng)學(xué)的研究中應(yīng)用最為廣泛。</p><p>　　2.1在動物系統(tǒng)發(fā)育重建中的應(yīng)用</p><p>　　利用C0I和16S基因片段鍵的DNA序列差異性構(gòu)建的分子系統(tǒng)樹已經(jīng)解決了很多動物之間的系統(tǒng)發(fā)生關(guān)系。鹟亞科（Muscicapinae）隸屬于雀形目鹟科，在全世界分布有328種。目前

39、國內(nèi)外對鹟亞科的分類系統(tǒng)很不統(tǒng)一。2007年報道，雷忻等人采用PCR擴(kuò)增、測序的方法，對鹟亞科6屬16種鳥類的線粒體COI基因序列1176bp進(jìn)行測定，并以荒漠伯勞和發(fā)冠卷尾作為外群構(gòu)建Bayes、ML、MP3棵系統(tǒng)發(fā)育樹。結(jié)果支持：壽帶屬、扇尾鹟屬、方尾鹟屬3屬于鹟亞科其他鳥類親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，扇尾鹟屬于方尾鹟屬親緣關(guān)系較近，鹟屬為單系發(fā)生。該結(jié)論解決了鹟亞科部分屬間的進(jìn)化關(guān)系，為鹟亞科分類系統(tǒng)的研究提供了分子水平證據(jù)。蟶類在食用貝類中占

40、有相當(dāng)重要的地位，基于形態(tài)性狀學(xué)對蟶類的分類存在某些不同觀點，齊鐘彥將3鐘蟶歸為竹蟶科（Solenidae），分屬竹蟶屬（Solen）和刀蟶屬（Cultellus），而徐鳳山則主張將長竹蟶（Solen strictus）、大竹蟶（Solen grandis）分為竹蟶科并將刀蟶屬提升為刀蟶科。針對這一爭議，陳麗梅等以C0I基因片段作為分子標(biāo)記初步研究了大竹蟶、長竹蟶和小刀蟶（Cu</p><p>　　2.2在動物遺

41、傳多樣性研究中的應(yīng)用</p><p>　　動物遺傳多樣性的研究對揭示動物表型多樣性的本質(zhì)及建立動物種質(zhì)資源庫的工作具有非常重要的意義。總體來說，該工作還處于起步階段。具有代表性的工作是關(guān)于梭子蟹的研究。梭子蟹是我國重要的海洋經(jīng)濟(jì)蟹類，做好梭子蟹科種質(zhì)資源的保護(hù)及可持續(xù)開發(fā)及利用具有非常重要的意義，因而梭子蟹明確科內(nèi)各屬的系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系是當(dāng)務(wù)之急。郭天慧等對三疣梭子蟹（Portunus trituberculatus

42、）線粒體C0I基因片段分析發(fā)現(xiàn)其種內(nèi)變異較低，在3個樣本中C0I基因片段有比較多的插入或缺失，同源性為37.2%，進(jìn)而奠定了以C0I基因片段研究梭子蟹遺傳多樣性的理論基礎(chǔ)。此外，吉鵬宇等人，對從廣東陽江，廣東吳川，廣東珠海，福建東山，海南?？?，海南三亞等六地區(qū)采集的六個青蟹群體進(jìn)行分子遺傳變異差異的研究，結(jié)果表明東山等六地青蟹群體根子遺傳背景基本相似。</p><p>　　2.3在蟹類中的研究</p>

43、<p>　　除了上述的兩項實驗，分子生物學(xué)手段研究系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系，在蟹類中的其他的研究也比較多。絨螯蟹是世界范圍內(nèi)重要的經(jīng)濟(jì)蟹類，長期有關(guān)于絨螯蟹的分類地位爭議很大，尤其是新絨螯蟹屬（Neoeriocheir）和和平絨螯蟹屬（Platyeriocheir）的有效性問題。針對以上問題，Tang等采用C0I基因片段探究了東亞地區(qū)的絨螯蟹屬系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系，采用NJ和ML法的聚類分析結(jié)果支持新絨螯蟹屬為一個獨立的屬，而直額絨螯蟹都是絨

44、螯蟹屬所有其他成員的姐妹群，因而不支持平絨螯蟹屬是一個有效的屬。國內(nèi)也有學(xué)者做過類似的研究。邱高峰等利用PCR技術(shù)，擴(kuò)增了中華絨螯蟹、獨額絨螯蟹線粒體16SrRNA片段，經(jīng)測序，與GenBank數(shù)據(jù)庫中的日本絨螯蟹和臺灣絨螯蟹16SrRNA同源序列進(jìn)行比較。結(jié)果表明，中華絨螯蟹與日本絨螯蟹親緣關(guān)系最近，然后與臺灣絨螯蟹聚為一支，獨額絨螯蟹則成為相對獨立的一支。此外，孫紅英等人做了中國大陸絨螯蟹線粒體16SrRNA序列變異與分子鑒定標(biāo)記工

45、作；孔曉瑜進(jìn)行了中華絨螯蟹與日本絨螯蟹線粒體C0I基因片段的序列比較研究。此外，徐敬明等測定了相手蟹屬紅螯相手蟹與褶痕相手蟹線粒體16SrRNA基</p><p><b>　　3.展望</b></p><p>　　線粒體基因以其特殊的組成結(jié)構(gòu)和演化方式在生物分子系統(tǒng)學(xué)的研究中具有不可取代的作用，并已經(jīng)廣泛地應(yīng)用與海洋動物的分類、系統(tǒng)進(jìn)化和遺傳多樣性等方面的研究中。但該

46、方法也有一定的局限性。由于C0I基因本身為中度保守序列，即在同一種下不同群體之間序列變異非常小，所以在利用C0I基因研究種以下分類階元的不同群體之間的系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系時，必須輔助以其他分子標(biāo)記才能確立同一種下不同群體之間的親緣關(guān)系?？傮w來說，迄今為止，對不同種類的蟹進(jìn)行分子生物學(xué)方法的系統(tǒng)發(fā)育分析還不多見，本實驗采用的實驗材料就包括了不同種類的蟹，相信可以給日后的蟹種間的差異分析提供一些參考數(shù)據(jù)和理論依據(jù)。</p><p

47、><b>　　參考文獻(xiàn)</b></p><p>　　[1] 陳麗梅, 孔曉瑜, 喻子牛, 等. 3種蟶類線粒體16SrRNA和C0I基因片段的序列比較及其系統(tǒng)學(xué)初步研究[A]. 海洋科學(xué), 2005,29(8):27-32</p><p>　　[2] 陳子安, 杜曉東, 王慶恒, 等. 3種星蟲線粒體16SrRNA、C0I和Cytb基因片段的序列比較[A]. 廣

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53、方華華,等.相手蟹屬兩種蟹類線粒體16SrRNA基因序列的比較[A]. 水產(chǎn)科學(xué), 2006,25(9):443-447</p><p>　　[15] 徐琰,宋林生,李新正.用16SrDNA序列初步探討部分真蝦類的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系[A]. 海洋科學(xué), 2005,29(9):36-41</p><p>　　[16] 孫紅英,周開亞,陸健健,等.中國大陸絨螯蟹線粒體16SrDNA序列變異與分子鑒定

54、標(biāo)記. 自然科學(xué)進(jìn)展, 2002,12(5):485-490</p><p>　　[17] 馬凌波,張鳳英,喬振國,等.中國東南沿海青蟹線粒體C0I基因部分序列分析[A]. 水產(chǎn)學(xué)報, 2006,30(4):463-468</p><p>　　[18] 麥維軍,謝珍玉,張呂平,等.中國明對蝦與5種蝦類線粒體16SrRNA和C0I基因片段的序列比較及其系統(tǒng)學(xué)初步研究[A]. 海南大學(xué)學(xué)報自然

55、科學(xué)版, 2009,27(1):15-23</p><p>　　[19] 郭奕慧,喻達(dá)輝,黃佳菊,等.中國主要養(yǎng)殖羅非魚親緣關(guān)系的C0I序列分析[A]. 華中農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報, 2009,28(1):75-79</p><p>　　[20] 孔曉瑜,喻子牛,劉亞軍,等.中華絨螯蟹與日本絨螯蟹線粒體C0I基因片段的序列比較研究. 青島海洋大學(xué)學(xué)報, 2001,31(6):861-866</

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57、 Press,2010,3-12</p><p>　　[22] ZHANG Qing-yi,CHENG Qi-qun,GUAN Wei-bing.Mitochondrial C0I Gene Sequence Variation and Taxonomic Status of Three Macrobrachium Species. Zoological Research 2009,30(6):613-619&l

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60、99(401):239-254</p><p>　　[25] MonicaM, EmestoW, AlinaMS. Examination of the montastraea annularis species complex using IFS and C0I sequences[J].MarBiotechnol,1999(1):89-97</p><p><b>　　本科畢

61、業(yè)設(shè)計</b></p><p><b>　?。?0_ _屆）</b></p><p>　　用16S rRNA基因?qū)欧N蟹系統(tǒng)學(xué)分析</p><p><b>　　目錄</b></p><p><b>　　1 引言2</b></p><p>　

62、　1.1 蟹類的生物學(xué)特征2</p><p>　　1.2 研究歷史與現(xiàn)狀2</p><p>　　1.3 研究意義4</p><p>　　1.4 主要研究內(nèi)容4</p><p>　　1.5 應(yīng)解決的問題4</p><p>　　2. 實驗材料與方法4</p><p><b>　

63、　2.1 樣品4</b></p><p><b>　　2.2 試劑4</b></p><p><b>　　2.3 設(shè)備4</b></p><p>　　2.4 實驗方法4</p><p>　　3. 結(jié)果與分析5</p><p>　　3.1 核苷酸組成分析

64、5</p><p>　　3.2 遺傳距離分析9</p><p>　　3.3 系統(tǒng)進(jìn)化樹10</p><p>　　4. 結(jié)果與討論10</p><p>　　4.1 線粒體基因與動物系統(tǒng)發(fā)育重建10</p><p>　　4.2 本研究中9種蟹的系統(tǒng)發(fā)育分析9</p><p><b&g

65、t;　　5. 小結(jié)10</b></p><p><b>　　致謝11</b></p><p><b>　　參考文獻(xiàn)12</b></p><p>　　摘 要：蟹類是水產(chǎn)養(yǎng)殖中的重要經(jīng)濟(jì)物種，分布廣泛于咸淡水中，具有一定的經(jīng)濟(jì)價值。但由于從形態(tài)學(xué)和細(xì)胞學(xué)上對其分類有一定的難度，所以利用分子生物學(xué)手段鑒定其種類

66、，研究其系統(tǒng)發(fā)育情況已經(jīng)成為主流。本文利用蟹類的線粒體16S rRNA基因片段序列分析的方法，對9種蟹類進(jìn)行了分子系統(tǒng)學(xué)研究。經(jīng)多重比對和軟件分析，得到了種間序列的遺傳距離并構(gòu)建了最大簡約（MP）系統(tǒng)樹。結(jié)果表明：秉氏厚蟹和日本蟳兩種蟹類具有較近的親緣關(guān)系，這與他們在傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)分類上的分類地位有出入。而其余蟹類的進(jìn)化關(guān)系與傳統(tǒng)分類學(xué)結(jié)果是相一致的。該研究可以為蟹類的分類問題及親緣關(guān)系提供一定的分子生物學(xué)依據(jù)。</p>&l

67、t;p>　　關(guān)鍵詞：蟹類；系統(tǒng)發(fā)育；線粒體16S rRNA基因；親緣關(guān)系</p><p>　　Abstract: Crab is an important economic aquaculture species, which widely distributed in salty and fresh water and has some economic value. However, due to th

68、e their classification based on morphology and cytology has a certain difficulty, so use the means of molecular biology to identify the types and study the phylogeny situation of them have becoming mainstream. In this pa

69、per, we use the mitochondrial 16S rRNA gene sequence analysis and carry out the 9 kinds of crabs molecular systematics. Af</p><p>　　Keywords: Crabs; Phylogenetic; Mitochondrial 16S rRNA gene; Relationships&l

70、t;/p><p><b>　　1 引言</b></p><p>　　1.1 蟹類的生物學(xué)特征</p><p><b>　　1.1.1 簡介</b></p><p>　　蟹是十足目（Decapoda）短尾次目的甲殼動物，尤指短尾族（Brachyura）的種類（真蟹），也包括其他一些類型，如歪尾族（Anom

71、ura）的種類。常見的有關(guān)公蟹、梭子蟹、溪蟹、招潮蟹、絨螯蟹等屬，總共約4500種，見于所有海洋、淡水及陸地。通常以步行或爬行的方式移動。蟹類通常為雜食性，多食腐，有些能與其他動物共生。</p><p>　　1.1.2 分布范圍</p><p>　　大部分蟹類生活于海中，甚至熱帶國家數(shù)量豐富的陸蟹，也不時到海里活動，其生命的早期也在海中度過。世界大部分溫暖地區(qū)都有豐富的淡水蟹資源，例如南歐

72、長于河水中的春蟹（Potamon fluviatile）。蛙蟹科、饅頭蟹科、玉蟹科、梭子蟹科、扇蟹科主要生活在沿岸帶；方蟹科、沙蟹科生活在廣闊的潮間帶。極少數(shù)如漂泊蟹和弓腿蟹能附著在木材或其他漂浮物上生活。也有不少種類與其他動物營共棲生活，如綿蟹科，關(guān)公蟹科。許多種如豆蟹常潛入一些軟體動物的外套腔中、或多毛類的管道中共棲。一小部分蟹類完全在淡水中生長繁殖，它們多棲息于山區(qū)溪流的石塊下。還有少數(shù)蟹類如地蟹能適應(yīng)陸地生活，穴居于潮濕的泥洞中

73、，繁殖時期則遷移下海。</p><p>　　1.1.3 形態(tài)特征</p><p>　　蟹的身體分為頭胸部與腹部。頭胸部的背面覆以頭胸甲，形狀因種不同而不一樣。額部中央具第1、2對觸角，外側(cè)是有柄的復(fù)眼?？谄靼?對大顎，2對小顎和3對顎足。頭胸甲兩側(cè)有5對胸足。腹部退化，扁平，曲折在頭胸部的腹面。雄性腹部窄長，多呈三角形，只有前兩對赴肢變形為交接器；雌性腹部寬闊，第2-5節(jié)各具1對雙枝型附

74、肢，密布剛毛，用以抱卵。</p><p>　　1.1.4 經(jīng)濟(jì)價值</p><p>　　蟹類中可供食用的主要有三疣梭子蟹、遠(yuǎn)海梭子蟹、青蟹和中華絨螯蟹等，具有較高的營養(yǎng)價值。蟹殼可用以提煉工業(yè)原料甲殼素，也可提制葡糖胺。有些蟹類可作中藥用。蟹幼體或成體可作飼餌或飼料。所以蟹類具有很好的經(jīng)濟(jì)價值和市場開發(fā)力。</p><p>　　1.2 研究歷史與現(xiàn)狀</p&g

75、t;<p><b>　　1.2.1 背景</b></p><p>　　幾乎所有蟹類的幼體剛從卵中孵出時外形與成體完全不同。幼體成為溞狀幼蟲，體微小，同名，圓形，無肢體，在海面上游泳。蛻皮幾次后體型開始增大，成為大眼幼體，這時身體及肢體才更像蟹，再蛻皮一次外形方似成體。所以在蟹幼體時，肉眼很難辨別其種類，但很久以來，關(guān)于海洋動物的分類及系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系研究仍局限于對其形態(tài)學(xué)和細(xì)胞學(xué)方

76、法。由于形態(tài)學(xué)和細(xì)胞學(xué)特征往往是基因表達(dá)的結(jié)果，可比較的分類信息較少且易受到環(huán)境等多種因素影響，所以關(guān)于包括蟹在內(nèi)的許多水生動物的分類及系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系一直是困擾人們的難題。自20世紀(jì)60年代以來，蛋白質(zhì)和DNA等信息大分子被廣泛應(yīng)用于生物系統(tǒng)學(xué)研究，克服了在利用形態(tài)學(xué)和細(xì)胞學(xué)方法對海洋動物做分類和系統(tǒng)進(jìn)化研究時的諸多缺點，消除了很多海洋動物分類和系統(tǒng)進(jìn)化研究中的爭議，極大地促進(jìn)了海洋動物分子系統(tǒng)學(xué)的發(fā)展[1]。DNA分子作為遺傳信息的直接

77、載體，不受環(huán)境、生物發(fā)育階段及器官組織的影響，因而能較為準(zhǔn)確地反映出各個物種間的系統(tǒng)發(fā)生關(guān)系。而在這其中，線粒體DNA（mtDNA）的優(yōu)勢又更加明顯。其具有母系遺傳、變異大、無組織特異性等優(yōu)點，且檢測方便，因而在動物的分類、遺傳變異分析和系統(tǒng)進(jìn)化等領(lǐng)</p><p>　　截止到目前為止，國內(nèi)外報道的利用C0I和16S rRNA基因?qū)ι镒鱿到y(tǒng)學(xué)分析的文章數(shù)量很多，但是所用的實驗材料也是涉及了多個種類的生物，其范圍

78、很廣，另外，同時結(jié)合C0I和16S rRNA基因研究方法的文章也不多，大部分是針對其中一種方法的研究。比如，有基于16S rRNA基因序列多樣性利用指紋方法構(gòu)建微生物的分類和識別系統(tǒng)[2]；利用對蝦屬線粒體DNA基因序列構(gòu)建其系統(tǒng)發(fā)生關(guān)系和演化史等。 </p><p>　　國內(nèi)的相關(guān)研究成果也有很多，其實驗對象涵蓋了脊椎和無脊椎動物的大部分種類，從原生動物到哺乳動物均有見報，但是作蟹類的系統(tǒng)學(xué)分析較為少見，也有一

79、些用蟹做的研究，但都局限于某一種屬的蟹類之間的比較。如，吉鵬宇[3]等做了六種青蟹群體的線粒體16S rRNA和COI基因部分序列差異的研究（2008）其中的觀點也得到了馬凌波的證實；有對三疣梭子蟹線粒體DNA16S rRNA和COI基因片段序列的比較研究[4]；相手蟹屬兩種蟹類線粒體16S rRNA基因序列的比較[5]等等諸如此類的分析報道。</p><p>　　1.2.2 在動物遺傳多樣性方面的研究</

80、p><p>　　動物遺傳多樣性的研究對揭示動物表型多樣性的本質(zhì)及建立動物種質(zhì)資源庫的工作具有非常重要的意義?？傮w來說，該工作還處于起步階段。具有代表性的工作是關(guān)于梭子蟹的研究。梭子蟹是我國重要的海洋經(jīng)濟(jì)蟹類，做好梭子蟹科種質(zhì)資源的保護(hù)及可持續(xù)開發(fā)及利用具有非常重要的意義，因而梭子蟹明確科內(nèi)各屬的系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系是當(dāng)務(wù)之急。郭天慧[4]等對三疣梭子蟹（Portunus trituberculatus）線粒體基因片段分析發(fā)現(xiàn)

81、其種內(nèi)變異較低，在3個樣本中基因片段有比較多的插入或缺失，同源性為37.2%，進(jìn)而奠定了以基因片段研究梭子蟹遺傳多樣性的理論基礎(chǔ)。此外，吉鵬宇[3]等人，對從廣東陽江，廣東吳川，廣東珠海，福建東山，海南?？冢Ｄ先齺喌攘貐^(qū)采集的6個青蟹群體進(jìn)行分子遺傳變異差異的研究，結(jié)果表明東山等六地青蟹群體根子遺傳背景基本相似。</p><p>　　1.2.3 在蟹類分類中的應(yīng)用</p><p>　　

82、除了上述的兩項實驗，分子生物學(xué)手段研究系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系，在蟹類中的其他的研究也比較多。一些國外學(xué)者采用C0I基因片段探究了東亞地區(qū)的絨螯蟹屬系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系，采用NJ和ML法的聚類分析結(jié)果支持新絨螯蟹屬為一個獨立的屬，而直額絨螯蟹都是絨螯蟹屬所有其他成員的姐妹群，因而不支持平絨螯蟹屬是一個有效的屬。國內(nèi)也有學(xué)者做過類似的研究。邱高峰[6]等利用PCR技術(shù)，擴(kuò)增了中華絨螯蟹、獨額絨螯蟹線粒體16S rRNA片段，經(jīng)測序，與GenBank數(shù)據(jù)庫中的

83、日本絨螯蟹和臺灣絨螯蟹16S rRNA同源序列進(jìn)行比較。結(jié)果表明，中華絨螯蟹與日本絨螯蟹親緣關(guān)系最近，然后與臺灣絨螯蟹聚為一支，獨額絨螯蟹則成為相對獨立的一支。此外，孫紅英[7]等人做了中國大陸絨螯蟹線粒體16S rDNA序列變異與分子鑒定標(biāo)記工作；孔曉瑜[8]進(jìn)行了中華絨螯蟹與日本絨螯蟹線粒體C0I基因片段的序列比較研究。此外，徐敬明[5]等測定了相手蟹屬紅螯相手蟹與褶痕相手蟹線粒體16S rRNA基因部分片段的序列，結(jié)果表明，分布與

84、中國的3種相手蟹種，無齒相手蟹和紅螯相手蟹的親緣關(guān)系最近，而它們與褶痕相手蟹的親緣關(guān)系則較遠(yuǎn)。</p><p><b>　　1.3 研究意義</b></p><p>　　線粒體基因以其特殊的組成結(jié)構(gòu)和演化方式在生物分子系統(tǒng)學(xué)的研究中具有不可取代的作用，并已經(jīng)廣泛地應(yīng)用與海洋動物的分類、系統(tǒng)進(jìn)化和遺傳多樣性等方面的研究中。總體來說，迄今為止，對不同種類的蟹進(jìn)行分子生物學(xué)

85、方法的系統(tǒng)發(fā)育分析還不多見，本實驗以不同種類的蟹為實驗材料進(jìn)行16S rRNA基因比較研究，期望可以給日后的蟹種間的差異份析提供一些參考數(shù)據(jù)和理論依據(jù)。</p><p>　　1.4 主要研究內(nèi)容</p><p>　　包括研究材料——不同種螃蟹的采集和購買；對樣品進(jìn)行一系列分子生物學(xué)處理，主要包括線粒體DNA的提取、PCR擴(kuò)增和產(chǎn)物純化、測序、數(shù)據(jù)分析以及系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建；得出最終結(jié)論，形成

86、論文。</p><p>　　1.5 應(yīng)解決的問題</p><p>　　通過對幾種蟹類的16S rRNA的序列等相關(guān)問題的研究，并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，從而弄清這幾種蟹類的在系統(tǒng)發(fā)育上的關(guān)系，進(jìn)一步實踐分子生物學(xué)手段在生物種類鑒別和系統(tǒng)發(fā)育研究上的優(yōu)勢。</p><p>　　2. 實驗材料與方法</p><p><b>　　2.1 樣品&l

87、t;/b></p><p>　　本實驗所用的樣品均采購于水產(chǎn)品市場，共計9種，分別是三疣梭子蟹（Portunus trituberculatus）、鋸緣青蟹（Scylla serrata）、中華絨螯蟹（Eriochier sinensis）、日本蟳（Charybdis japonica）、秉氏厚蟹（Helice pingi）、隆線拳蟹（Philyra carinata）（俗稱和尚蟹）、日本大眼蟹（Macro

88、phthalmus japonicus）、紅星梭子蟹（Portunus sanguinolentus）和細(xì)點圓趾蟹（Ovalipes punctatus）。每種螃蟹取2只個體，其中1只活體解剖后，取一定量的肌肉組織于1.5ml的離心管中，放置于-80℃保存?zhèn)溆茫涣硪恢环胖糜跇?biāo)本瓶中，用70%的酒精浸泡，以便于查證。</p><p><b>　　2.2 試劑</b></p>&l

89、t;p>　　本實驗用到的試劑有：Lisis細(xì)胞裂解液、20mg/ml蛋白酶K、苯酚：氯仿：異戊醇（25:24:1）混合液、氯仿：異戊醇（24:1）混合液、3M乙酸鈉溶液、80%冰乙醇、TE溶解緩沖液、25μl PCR反應(yīng)液、10μmol/L的正、反方向引物、去離子水。</p><p><b>　　2.3 設(shè)備</b></p><p>　　本實驗用到的設(shè)備有關(guān)：超

90、低溫冰箱、水浴鍋、離心機(jī)、PCR擴(kuò)增儀，電泳儀。</p><p><b>　　2.4 實驗方法</b></p><p>　　2.4.1 基因組DNA的提取</p><p>　　DNA的提取參照《分子克隆實驗指南》（Sambrook等，2001）的苯酚-氯仿抽提法抽提基因組DNA，具體步驟如下：</p><p>　?。?）

91、取100mg附肢肌肉，置于1.5mL離心管中，加入100μl Lisis裂解緩沖液，剪刀剪碎肌肉；</p><p>　　（2）加入450μl Lysis裂解液和4.5μl 20mg/mL蛋白酶K，充分混勻，55℃水浴3-4h 至澄清；（每隔20min搖一下，至液體呈透亮。）</p><p>　?。?）冷卻至室溫，加入550μl 苯酚：氯仿：異戊醇（25:24:1），去蛋白，上下顛倒混勻10

92、min，12000rpm，4℃離心10min；</p><p>　?。?）吸取上清液于新的離心管中，加入等體積的氯仿：異戊醇（24:1），除去殘留蛋白及酚，上下顛倒混勻5min，12000rpm，4℃離心10min；</p><p>　?。?）小心吸取上清液于新的離心管中，加入0.8倍體積的3M乙酸鈉溶液，-20℃沉淀30min，12000rpm，4℃離心10min；</p>

93、<p>　　（6）棄上清，800μl 70%冰乙醇洗滌，10000rpm，4℃離心8min；</p><p>　　（7）棄上清，室溫下風(fēng)干沉淀，加入100μl TE溶解緩沖液溶解沉淀；</p><p>　?。?）產(chǎn)物在1%的瓊脂糖凝膠中電泳，凝膠成像系統(tǒng)觀察檢測是否有目的條帶后，-20℃保存?zhèn)溆谩?lt;/p><p>　　2.4.2 PCR擴(kuò)增</p&

94、gt;<p>　　基因片段擴(kuò)增所用引物的核苷酸序列為：16Sr RNA引物1：5-GCCTGTTTATCAAAAACAT-3，引物2：5-CCGGTCTGAACTCAGATCACGT-3。PCR反應(yīng)總體積為25μl，其中含模板DNA50~100 ng，10×PCR buffer 2.5μl，上、下游引物各0.12μmol/L，dNTPs 0.2 mmol/L，MgCl22 mmol/L，Taq酶(TIANGEN)

95、0.2 U。在iCycler熱循環(huán)儀(BIO-RAD)上進(jìn)行PCR反應(yīng)：94℃預(yù)變性2 min；94℃變性45 s，48℃退火1 min，72℃延伸1 min，35個循環(huán)；72℃延伸5 min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.2%瓊脂糖凝膠檢測，電泳緩沖液為1×TAE(pH 8.0)，電壓為4 V/cm，常溫電泳，核酸染料染色，于凝膠成像系統(tǒng)下觀察并拍照記錄。</p><p>　　2.4.3 PCR產(chǎn)物純化及測序&

96、lt;/p><p>　　PCR產(chǎn)物電泳檢測后，于紫外燈下切割目的條帶，用上海生工公司UNIQ-10PCR產(chǎn)物純化試劑盒純化。采用ABI PRISMTM測序系統(tǒng)進(jìn)行雙向測序。</p><p>　　2.4.4 數(shù)據(jù)分析</p><p>　　測序后所有序列用INFORMAX軟件進(jìn)行編輯、校對和對位排序，并對排序結(jié)果進(jìn)行分析和手工校正。然后采用MEGA4.0分子進(jìn)化遺傳分析軟件

97、對所有目的基因片段進(jìn)行數(shù)據(jù)處理及群體遺傳結(jié)構(gòu)分析，計算核苷酸組成和種間遺傳距離，基于最大簡約法構(gòu)建該類群的16S rRNA的分子系統(tǒng)樹，節(jié)點的置信度檢驗采用Bootstrap分析（1000個循環(huán)）。</p><p><b>　　3. 結(jié)果與分析</b></p><p>　　3.1 核苷酸組成分析</p><p>　　將擴(kuò)增得到的9種螃蟹的16S

98、 rRNA序列用CLUSTUAL X 1.8軟件進(jìn)行比對。將比對結(jié)果手工剪切，校正后用MEGA4.0統(tǒng)計，結(jié)果發(fā)現(xiàn)每種樣品的A+T含量均高于G+C含量，符合線粒體DNA堿基組成特點。9種螃蟹的同源序列組成見圖1，其核苷酸組成百分比見表1。</p><p>　　圖1. 9種螃蟹16S rRNA同源片段組成</p><p>　　Fig1. Homologou fragments of 16S

99、 rRNA for 9 species of Crab</p><p>　　表1 9種螃蟹16S rRNA基因片段核苷酸組成特征</p><p>　　Table1. Nucleotide composition of 16S rRNA for 9 species of Crab</p><p>　　16S rRNA基因片段經(jīng)CLUSTAL X 1.8比對分析，共截

100、取642個堿基組成的同源片段，其中有102個堿基序列為保守序列，不計插入/缺失片段，有640個位點存在核苷酸變異。其中，相對保守的序列片段分布于89bp到189bp之間。所有比對片段中A、C、G、T的平均含量分別為36.3%、14.2%、13.1%、和36.4%，A+T的含量較高，平均為72.7%。</p><p>　　3.2 遺傳距離分析</p><p>　　將9種蟹類的16S rRNA

101、基因片段的比對結(jié)果輸入軟件，根據(jù)序列變異和堿基轉(zhuǎn)換比值和顛換比值的加和值，計算物種之間的相對遺傳距離，并構(gòu)成矩陣，具體見表2。9種蟹類的16S rRNA基因序列遺傳矩陣顯示，其最小遺傳距離僅為58.000，出現(xiàn)在三疣梭子蟹和紅星梭子蟹之間，說明它們的親緣關(guān)系較近。</p><p>　　表2 9種蟹類16S rRNA基因序列的相對遺傳距離矩陣</p><p>　　Table2. Pairw

102、ise distance matrix of 16S rDNA gene fragment among 9 species of Crab</p><p><b>　　3.3 系統(tǒng)進(jìn)化樹</b></p><p>　　用最大簡約法（Maximum Parsimony）構(gòu)建9種蟹類的16S rRNA基因序列系統(tǒng)演化樹。在構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)生樹時，用Bootsrap法檢驗，1000

103、次重復(fù)抽樣得到結(jié)點的置信度以自引導(dǎo)值估計。9種蟹類的系統(tǒng)發(fā)生樹見圖2。</p><p>　　圖2 9種蟹類的16S rRNA序列系統(tǒng)樹</p><p>　　Fig2. Phylogenetic relationships among 9 species based on MP analysis from 16S rRNA data</p><p><b>

104、;　　4. 結(jié)果與討論</b></p><p>　　4.1 線粒體基因與動物系統(tǒng)發(fā)育重建</p><p>　　線粒體基因已經(jīng)被證明適合于分子系統(tǒng)學(xué)研究，在細(xì)菌、貝類、蝦類、蟹類和魚類等生物的分子系統(tǒng)學(xué)研究中均被廣泛地應(yīng)用。盡管線粒體DNA僅占整個真核生物總DNA的1%以下，但其在研究物種的遺傳分化方面具有獨到的優(yōu)勢。其中，利用C0I和16S基因片段鍵的DNA序列差異性構(gòu)建的分子

105、系統(tǒng)樹已經(jīng)解決了很多動物之間的系統(tǒng)發(fā)生關(guān)系。2007年報道，雷忻[9]等人采用PCR擴(kuò)增、測序的方法，對鹟亞科6屬16種鳥類的線粒體COI基因序列1176bp進(jìn)行測定，并以荒漠伯勞和發(fā)冠卷尾作為外群構(gòu)建Bayes、ML、MP 3棵系統(tǒng)發(fā)育樹。結(jié)果支持：壽帶屬、扇尾鹟屬、方尾鹟屬3屬于鹟亞科其他鳥類親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，扇尾鹟屬于方尾鹟屬親緣關(guān)系較近，鹟屬為單系發(fā)生。該結(jié)論解決了鹟亞科部分屬間的進(jìn)化關(guān)系，為鹟亞科分類系統(tǒng)的研究提供了分子水平證據(jù)。

106、此外，陳麗梅[10]等以C0I基因片段作為分子標(biāo)記初步研究了大竹蟶、長竹蟶和小刀蟶（Cultellus attenuatus）之間的分子系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系，統(tǒng)計數(shù)據(jù)結(jié)果顯示大竹蟶與長竹蟶的遺傳距離為0.1712，而兩竹蟶類與小刀蟶的遺傳距離分別為0.2662和0.2933，作者認(rèn)為小刀蟶與竹蟶之</p><p>　　4.2 本研究中9種蟹的系統(tǒng)發(fā)育分析</p><p>　　從分析得到的9種蟹類的

107、遺傳距離表中可以注意到，除了三疣梭子蟹和紅星梭子蟹的距離最近之外，秉氏厚蟹和日本蟳的距離也較近，為86.000。從系統(tǒng)發(fā)育樹上看，兩種螃蟹也是單獨聚成一支。但根據(jù)1991年出版的《浙江動物志——甲殼類》一書[22]中，我們可以查到，秉氏厚蟹屬于方蟹科（Grapsinae），相手蟹亞科（Sesaarminae），厚蟹屬（Helice），而日本蟳屬于梭子蟹科（Portunidae），梭子蟹亞科（Portuninae），蟳屬（Charybdi

108、s），按照傳統(tǒng)的分類學(xué)，秉氏厚蟹應(yīng)該與同屬于方蟹科的中華絨螯蟹的親緣關(guān)系更近。將它們的16S rRNA序列經(jīng)過INFORMAX軟件分析比對后發(fā)現(xiàn)，秉氏厚蟹與日本蟳的序列相似性達(dá)到了69.2%，而秉氏厚蟹與中華絨螯蟹的序列相似性只有44.8%。從形態(tài)學(xué)上看，秉氏厚蟹和日本蟳在眼窩、頭胸甲形狀和步足形狀等方面均有不同。從生活習(xí)性上看，秉氏厚蟹生活在潮間帶泥沙灘上，而日本蟳生活于低潮線附近，棲居于有水草或泥沙的水底或潛伏于石下。從地理分布上看