慢性乙型病毒性肝炎中醫(yī)虛證的蛋白質(zhì)組學(xué)規(guī)律初探.pdf

1、目的:運(yùn)用蛋白質(zhì)組學(xué)方法,尋找慢性乙肝中醫(yī)肝腎陰虛證、脾腎陽(yáng)虛證患者外周血漿中差異表達(dá)的蛋白質(zhì),分析其與慢性乙肝中醫(yī)虛證證侯的對(duì)應(yīng)關(guān)系,初步探索出慢性乙肝中醫(yī)虛證的蛋白質(zhì)組學(xué)規(guī)律,為中醫(yī)臨床辨識(shí)慢性乙肝虛證提供可供參考的客觀化指標(biāo),最終為進(jìn)一步探討慢性乙肝中醫(yī)虛證的分子基礎(chǔ)提供線索。方法:通過(guò)雙向凝膠電泳,獲得正常對(duì)照組、肝腎陰虛證組、脾腎陽(yáng)虛證組的血漿蛋白質(zhì)(Two-dimensionalelectrophoresis,2-DE)圖譜

2、,經(jīng)質(zhì)譜分析鑒定出差異表達(dá)的蛋白質(zhì)。具體方法:依據(jù)《病毒性肝炎中醫(yī)辨證標(biāo)準(zhǔn)》,在瀘州醫(yī)學(xué)院附屬中醫(yī)醫(yī)院2008年5月～2009年8月期間的住院和門診慢性乙肝患者中,收集典型的肝腎陰虛證、脾腎陽(yáng)虛證及健康正常人各三例作為研究對(duì)象,對(duì)其血漿蛋白進(jìn)行雙向凝膠電泳。第一向采用PH4-7的固相PH梯度膠條(immobilized pHgradients,IPG)等電聚焦(isoelectrofocusing,IEF),第二向采用濃度為12％的十二

3、烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(sodium-dodecyl sulphate-polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE)。硝酸銀染色后并經(jīng)凝膠圖像采集系統(tǒng)獲得血漿蛋白質(zhì)2-DE圖譜,采用ImageMaster2D Platinum V5.0軟件對(duì)組內(nèi)及組間的圖譜對(duì)比分析,依據(jù)IPG膠條的固相PH梯度中等電點(diǎn)pI線性梯度和標(biāo)準(zhǔn)分子量Marker,確定各蛋白點(diǎn)的相對(duì)分子量(Da)、相對(duì)等電點(diǎn)(

4、pI),將實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組的雙向電泳結(jié)果出現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)化總灰度值(％Vol)相差達(dá)2倍以上的蛋白點(diǎn)視為差異表達(dá)蛋白質(zhì),切取相應(yīng)的差異表達(dá)蛋白點(diǎn)作質(zhì)譜分析,搜索SWISS-PROT數(shù)據(jù)庫(kù),鑒定出各差異表達(dá)的蛋白質(zhì),初步建立起差異表達(dá)的蛋白質(zhì)與慢性乙肝虛證的對(duì)應(yīng)關(guān)系。結(jié)果:(1)各組血漿蛋白2-DE圖譜中大多數(shù)蛋白點(diǎn)分布在p14.5-6.5,分子量25—90kD的范圍內(nèi)。經(jīng)ImageMaster2D Platinum v5.0軟件分析,各組均可獲得

5、重復(fù)性穩(wěn)定的蛋白點(diǎn)約450±100個(gè)。(2)慢性乙肝中肝腎陰虛證組的2-DE圖譜與正常組對(duì)比表現(xiàn)為蛋白點(diǎn)4、7表達(dá)量明顯升高,蛋白點(diǎn)3、8、9表達(dá)量明顯下降。經(jīng)質(zhì)譜分析鑒定并結(jié)合Swiss-prot蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)得出:蛋白點(diǎn)4為C-反應(yīng)蛋白(C-reactive protein CRP)、蛋白點(diǎn)7為甲狀腺素結(jié)合蛋白(Thyroxine—binding protein TTR)、蛋白點(diǎn)3為載脂蛋白A2(Apo-A2)、蛋白點(diǎn)8、9為同一蛋白-

6、-結(jié)合珠蛋白(Haptoglobin HP)。(3)慢性乙肝中脾腎陽(yáng)虛證組的2-DE圖譜與正常組對(duì)比表現(xiàn)為蛋白點(diǎn)1、2、3、7、8、9表達(dá)量明顯下降,蛋白點(diǎn)5、6表達(dá)量明顯升高。經(jīng)質(zhì)譜分析鑒定并結(jié)合Swiss-prot蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)得出:蛋白點(diǎn)1為載脂蛋白C2(Apo-C2)、蛋白點(diǎn)2為血清淀粉蛋白P(Serum amyloid SAP)、蛋白點(diǎn)3為(APO-A2)、蛋白點(diǎn)7為甲狀腺素結(jié)合蛋白(TTR)、蛋白點(diǎn)8、9為同一蛋白--結(jié)合珠蛋白

7、(HP)、蛋白點(diǎn)5、6為同一蛋白--血漿視黃醇結(jié)合蛋白(Plasmaretinol—binding protein RBP)。(4)歸納總結(jié)慢性乙肝中醫(yī)二虛證與正常對(duì)照組2-DE圖譜發(fā)現(xiàn),慢性乙肝中醫(yī)二虛證與正常人相比存在明顯的規(guī)律性差異,表現(xiàn)為蛋白點(diǎn)3、8、9(分別為APO-A2、HP)表達(dá)量均明顯下降。結(jié)論:(1)成功建立起慢性乙肝肝腎陰虛證組、脾腎陽(yáng)虛證及正常對(duì)照組血漿蛋白質(zhì)組2-DE圖譜。(2)慢性乙肝中肝腎陰虛證組除了APO-

8、A2、HP明顯下降外,還表現(xiàn)CRP、TTR表達(dá)量明顯升高,而在正常人和脾腎陽(yáng)虛證組中均未體現(xiàn),推測(cè)CRP、TTR.表達(dá)量的升高參與了慢性乙肝中肝腎陰虛證侯的形成機(jī)制。進(jìn)一步深入研究,可望為臨床該證型的診斷提供客觀化分子指標(biāo)。(3)慢性乙肝中脾腎陽(yáng)虛證組除了APO-A2、HP表達(dá)量明顯下降外,還表現(xiàn)為Apo-C2、SAP、TTR.表達(dá)量明顯下降,RBP表達(dá)量明顯升高,推測(cè)這些蛋白質(zhì)表達(dá)量的變化可能與慢性乙肝中脾腎陽(yáng)虛證的病理機(jī)制相關(guān)。臨床