Asia-Ⅰ型口蹄疫病毒P1-2A和3CD基因及IL-18基因重組腺病毒載體的構(gòu)建.pdf

1、口蹄疫(Food-and-Mouthdisease，F(xiàn)MD)是世界性重大動物疫病之一，被世界動物衛(wèi)生組織和我國政府列為A類和一類傳染病之首。為了給FMD的防控提供更安全、高效的防控產(chǎn)品，本研究通過細菌內(nèi)同源重組法將Asia-Ⅰ型FMDVP1-2A，3CD基因以及白介素基因(IL-18)與復(fù)制缺陷型人5型腺病毒載體重組，成功構(gòu)建了重組腺病毒載體。為Asia-Ⅰ型口蹄疫病毒腺病毒活載體疫苗的研究積累了基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。 1)克隆了Asia-

2、Ⅰ型口蹄疫病毒P1-2A和3CD基因。序列測定表明：P1-2A長2247bp，編碼749個氨基酸；3CD長2052bp包括終止子TAA，共編碼683個氨基酸。經(jīng)與其它Asia-Ⅰ型FMDV株進行比對，該毒株與IND01和云南寶山毒株的序列同源性相對較高，P1-2A基因核苷酸序列同源性分別為92.5％和84.9％，與IND01毒株屬于同一基因亞型。 2)將目的基因和穿梭載體用相應(yīng)的內(nèi)切酶酶切后連接，將陽性的重組腺病毒穿梭質(zhì)粒用Pm

3、eI單酶切線性化后與腺病毒骨架載體在BJ5183細胞中進行同源重組，將鑒定為陽性的重組腺病毒質(zhì)粒轉(zhuǎn)化DH5a感受態(tài)菌用于擴增，用于轉(zhuǎn)化293細胞包裝成熟重組腺病毒。正確的重組有二種方式即左右臂之間同源重組和起始點與右臂同源重組，酶切可以切出35Kb的大片段和3.0Kb或4.5Kb的小片段。本實驗中切出35Kb、和4.5Kb的條帶，為起始點與右臂同源重組。 3)用線性化的重組腺病毒轉(zhuǎn)染293細胞，獲得基因組結(jié)構(gòu)均一的重組腺病毒。將

4、鑒定陽性的重組腺病毒質(zhì)粒用PacI酶切線性化借助脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染至293細胞，7天左右包裝成成熟的重組腺病毒。用此重組腺病毒再次感染293細胞，2-3天后可見細胞病變(CPE)，病變細胞漲大變圓、聚集，產(chǎn)生典型的腺病毒葡萄樣病變。測定第10代重組腺病毒的毒價為106.61TCID50/0.1ml 4)將重組腺病毒在豚鼠中進行了初步免疫效力試驗。將傳代穩(wěn)定，毒價高的重組腺病毒處理后用于免疫豚鼠，定期采血，用間接ELISA法測定血清抗體，