初步建立作用于人CXCR4啟動(dòng)子藥物的篩選方法.pdf

1、背景和目的：獲得性免疫缺陷綜合征(Acquired immunodeficiency syndrome,AIDS)是由人類(lèi)免疫缺陷病毒(Human immunodeficiency virus,HIV)感染引起的。HIV進(jìn)入CD4~+細(xì)胞是通過(guò)病毒的衣殼糖蛋白、CD4受體與趨化因子受體之間相互作用而完成的。CD4分子是HIV-1感染宿主細(xì)胞的主要受體,可是,在HIV病毒感染的過(guò)程中,都需要有輔助受體與CD4協(xié)同作用。CXCR4(CXC-

2、chemokine receptor4,CXCR4)作為第一個(gè)被發(fā)現(xiàn)的輔助受體,主要分布在機(jī)體的免疫細(xì)胞表面,屬七次跨膜的G蛋白偶聯(lián)膜受體,與CXCR1-CXCR6、CCR1-CCR11、XCR1和XCR2等同屬于趨化因子受體家族。HIV病毒在感染宿主細(xì)胞過(guò)程中,病毒表面的糖蛋白gp120先與細(xì)胞表面CD4受體結(jié)合,吸附于宿主細(xì)胞上,然后gp120再與輔助受體(CXCR4或CCR5)相互作用,病毒進(jìn)一步接近宿主細(xì)胞,病毒表面跨膜蛋白gp

3、41構(gòu)象發(fā)生變化,導(dǎo)致病毒包膜與宿主胞膜融合,病毒的RNA進(jìn)入細(xì)胞。近年來(lái),針對(duì)于病毒吸附與穿入環(huán)節(jié)的抗HIV藥物成為研究的熱點(diǎn)。中藥作是我國(guó)獨(dú)特的藥物資源寶庫(kù),種類(lèi)繁多,作用各異,其中是否存在能影響CXCR4啟動(dòng)子的活性、降低CXCR4的表達(dá),從而起到預(yù)防、治療AIDS的藥物,是值得進(jìn)一步研究的問(wèn)題。為此,本實(shí)驗(yàn)擬建立一種方法,篩選作用于CXCR4啟動(dòng)子的具有潛在抗HIV/AIDS作用的中藥。我們先將CXCR4啟動(dòng)子片段克隆到pGL4

4、載體上,再將構(gòu)建好的帶有CXCR4啟動(dòng)子的螢光素酶報(bào)告基因轉(zhuǎn)染入急性淋巴瘤細(xì)胞(Jurkat細(xì)胞),利用載體上的篩選標(biāo)記neo基因,用G418篩選得到穩(wěn)定轉(zhuǎn)染克隆。然后選取13種中藥分別給大鼠連續(xù)灌胃七天后采血,分離出含藥血清刺激轉(zhuǎn)染細(xì)胞株,通過(guò)檢測(cè)報(bào)告基因螢光素酶的活性,判斷這些中藥對(duì)CXCR4啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄作用的影響,建立作用于HIV輔助受體CXCR4啟動(dòng)子的抗HIV/AIDS藥物體外篩選方法。
　　方法：設(shè)計(jì)并合成擴(kuò)增CXCR4

5、啟動(dòng)子的引物,從含有CXCR4啟動(dòng)子序列的pUC-CXCR4質(zhì)粒中PCR擴(kuò)增CXCR4的啟動(dòng)子基因序列;將CXCR4啟動(dòng)子基因片段克隆入T載體(pGEM-T-CXCR4),再亞克隆進(jìn)pGL4螢光素酶報(bào)告載體,PCR、雙酶切篩選陽(yáng)性重組子,并進(jìn)行DNA序列測(cè)定,得到pGL4-CXCR4;脂質(zhì)體包裹轉(zhuǎn)染pGL4-CXCR4入Jurkat細(xì)胞(急性T淋巴細(xì)胞白血病細(xì)胞),G418篩選得到穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株,擴(kuò)大培養(yǎng)后分組;使用13種中藥煎劑(黃芩

6、、黃連、黃柏、金銀花、連翹、半邊蓮、魚(yú)腥草、大青葉、板藍(lán)根、靈芝、穿心蓮、豬苓、甘草),分別給成年Wistar大鼠連續(xù)灌胃7天后采血,分離含藥血清;將13種含藥血清分別作用于各組穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞后,通過(guò)檢測(cè)報(bào)告基因螢光素酶活性反映各含藥血清對(duì)CXCR4啟動(dòng)子的作用。結(jié)果數(shù)據(jù)用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件SPSS13.0分析。
　　結(jié)果：1.PCR擴(kuò)增CXCR4啟動(dòng)子基因片段,電泳可見(jiàn)777bp處有明亮條帶,與設(shè)計(jì)一致。2.將CXCR4啟動(dòng)子基因片段與p

7、GEM-T Easy連接后,轉(zhuǎn)化DH5α,篩選鑒定后得到重組子pGEM-T-CXCR4。3.將CXCR4啟動(dòng)子基因片段亞克隆入螢光素酶報(bào)告基因載體pGL4,得到螢光素酶報(bào)告質(zhì)粒pGL4-CXCR4。PCR擴(kuò)增及雙酶切鑒定證明插入序列正確,DNA序列測(cè)序,結(jié)果與設(shè)計(jì)完全一致。4.G418篩選得到穩(wěn)定轉(zhuǎn)染pGL4-CXCR4細(xì)胞株。5.螢光素酶活性檢測(cè):黃柏組細(xì)胞的螢光素酶螢光值為406175.2±35146.2,魚(yú)腥草組為612186.8

8、±38890.9,與對(duì)照組螢光值869159.0±62618.8相比,顯著降低(P<0.05);半邊蓮組細(xì)胞的螢光素酶螢光值為1146839±106138.3,較對(duì)照組顯著升高(P<0.05)。
　　結(jié)論：1.構(gòu)建CXCR4啟動(dòng)子的螢光素酶報(bào)告基因載體,應(yīng)用血清藥理學(xué)方法,建立起作用于CXCR4啟動(dòng)子藥物的體外篩選方法。2.黃柏和魚(yú)腥草可降低體外培養(yǎng)細(xì)胞中CXCR4啟動(dòng)子的活性,可能具有潛在的抗HIV/AIDS作用,值得進(jìn)一步的實(shí)