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文檔簡(jiǎn)介
1、前列腺癌是西方國(guó)家常見(jiàn)的惡性腫瘤,我國(guó)前列腺癌的發(fā)病率雖比西方國(guó)家低,但隨著人們生活水平的提高及生活習(xí)慣的改變,近年來(lái)前列腺癌發(fā)病率呈不斷上升趨勢(shì),成為影響我國(guó)老年男性生活質(zhì)量及預(yù)期壽命的重大疾病。在前列腺癌治療中,盡管大部分前列腺癌在早期治療中療效顯著,但是部分表現(xiàn)出較強(qiáng)的侵襲性、易復(fù)發(fā)甚至出現(xiàn)轉(zhuǎn)移,內(nèi)分泌治療晚期幾乎都出現(xiàn)激素抵抗,治療這些前列腺癌使用現(xiàn)有的治療方式往往會(huì)顯得捉襟見(jiàn)肘。近年來(lái),隨著分子生物學(xué)研究的進(jìn)展,基因治療逐漸成
2、為腫瘤學(xué)研究的熱點(diǎn),呈現(xiàn)出良好的應(yīng)用前景。如何使得基因治療對(duì)腫瘤的選擇性強(qiáng),對(duì)正常細(xì)胞干擾小,對(duì)晚期腫瘤或轉(zhuǎn)移瘤灶仍有效等理念,越來(lái)越受到人們的重視。
目前,具有在特定腫瘤細(xì)胞中條件性增殖復(fù)制并最終裂解腫瘤細(xì)胞的條件型溶瘤腺病毒,引起了人們極大關(guān)注,溶瘤病毒用于腫瘤治療的研究發(fā)展非常迅速。溶瘤病毒不但自身在腫瘤細(xì)胞內(nèi)復(fù)制導(dǎo)致細(xì)胞溶解和死亡,而且通過(guò)受感染的細(xì)胞釋放出更多的病毒顆粒,產(chǎn)生一種級(jí)聯(lián)放大效應(yīng),直至腫瘤細(xì)胞被清除。目前
3、已可利用基因工程手段使溶瘤效應(yīng)更加具有特異性和條件性,溶瘤腺病毒可以針對(duì)不同腫瘤加載其腫瘤特異性啟動(dòng)子,使得溶瘤病毒僅在特異的腫瘤組織中保持高活性,發(fā)揮溶解腫瘤細(xì)胞的功效。趨化因子受體CXCR4是近年來(lái)腫瘤研究領(lǐng)域中的熱點(diǎn),趨化因子受體CXCR4屬于趨化因子受體家族,是一個(gè)具有352個(gè)氨基酸且高度保守受體蛋白,為七次跨膜的G蛋白偶聯(lián)膜受體,已被證實(shí)在多種腫瘤細(xì)胞中高度特異性表達(dá)。目前,已有研究證實(shí)CXCR4啟動(dòng)子在腎癌和神經(jīng)膠質(zhì)瘤中呈現(xiàn)
4、腫瘤特異性,這提示CXCR4啟動(dòng)子極有可能成為前列腺癌基因治療中腫瘤特異性啟動(dòng)子的候選者。
因此,本研究重點(diǎn)評(píng)價(jià)并比較CXCR4啟動(dòng)子調(diào)控的條件復(fù)制性腺病毒Ad-CXCR4-E1對(duì)前列腺癌細(xì)胞生長(zhǎng)抑制的情況,分為如下部分:
第一部分 CXCR4在前列腺癌細(xì)胞與前列腺上皮細(xì)胞中的表達(dá)差異
目的:觀察趨化因子受體CXCR4在前列腺癌細(xì)胞LNCaP、PC-3、前列腺上皮細(xì)胞RWPE-1中的表達(dá),探討趨化因子受體C
5、XCR4在癌細(xì)胞和正常細(xì)胞系的表達(dá)差異。
方法:常規(guī)培養(yǎng)前列腺癌細(xì)胞LNCaP、PC-3、前列腺上皮細(xì)胞RWPE-1,通過(guò)采用半定量RT-PCR法檢測(cè)LNCaP、PC-3、RWPE-1中CXCR4基因在轉(zhuǎn)錄水平上的表達(dá)情況,Western blot印跡檢測(cè)CXCR4在LNCaP、PC-3、RWPE-1細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄后水平的表達(dá)情況。
結(jié)果:三種細(xì)胞中都可以檢測(cè)到CXCR4的表達(dá),但在前列腺癌細(xì)胞中,CXCR4存在高水平的
6、表達(dá)(p<0.01)。對(duì)于前列腺癌各細(xì)胞之間,CXCR4的表達(dá)水平為L(zhǎng)NCaP>PC-3(P<0.05)。
結(jié)論:通過(guò)三種細(xì)胞系的比較,前列腺癌細(xì)胞LNCaP及PC-3中存在CXCR4高表達(dá),提示前列腺癌細(xì)胞中存在CXCR4特異性高表達(dá)。
第二部分 CXCR4啟動(dòng)子的克隆及其在前列腺癌細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄特異性分析
目的:評(píng)估CXCR4啟動(dòng)子在前列腺癌細(xì)胞中的特異轉(zhuǎn)錄活性。
方法:采用PCR方法擴(kuò)增CXCR
7、4啟動(dòng)子序列,將其克隆到含有報(bào)告基因紅色熒光蛋白的質(zhì)粒載體pDsRed2-1和含有熒光素酶(LUC2)的質(zhì)粒載體pGL4.17,經(jīng)脂質(zhì)體分別轉(zhuǎn)染前列腺癌細(xì)胞LNCaP、PC-3和前列腺上皮細(xì)胞RWPE-1。熒光顯微鏡下觀察DsRed2的表達(dá)情況,并測(cè)定CXCR4啟動(dòng)子在三種細(xì)胞中的熒光素酶活性。
結(jié)果:CXCR4啟動(dòng)子僅在前列腺癌細(xì)胞中表現(xiàn)出特異的轉(zhuǎn)錄活性,其中LNCaP中啟動(dòng)子活性高于PC-3(P<0.05)。前列腺上皮細(xì)胞
8、RWPE-1中幾乎觀測(cè)不到DsRed2的表達(dá)。熒光素酶活性表明CXCR4啟動(dòng)子在前列腺癌細(xì)胞中的活性遠(yuǎn)高于前列腺上皮細(xì)胞(P<0.001)。
結(jié)論:CXCR4啟動(dòng)子在前列腺癌細(xì)胞中具有較強(qiáng)的特異轉(zhuǎn)錄活性,提示CXCR4啟動(dòng)子可以作為前列腺癌基因靶向治療的“特異開(kāi)關(guān)”。
第三部分 CXCR4調(diào)控的條件復(fù)制型腺病毒對(duì)人前列腺癌細(xì)胞特異性殺傷作用
目的:用CXCR4調(diào)控的條件復(fù)制型腺病毒Ad-CXCR4-E1感染
9、人前列腺癌細(xì)胞LNCaP,PC-3及人正常前列腺上皮細(xì)胞RWPE-1,通過(guò)檢測(cè)細(xì)胞存活率評(píng)價(jià)條件復(fù)制性腺病毒對(duì)于前列腺癌細(xì)胞的特異性殺傷。
方法:采用RT-PCR法從人胚腎293細(xì)胞(HEK293)中擴(kuò)增條件復(fù)制型腺病毒必需的E1區(qū)基因,構(gòu)建含有CXCR4啟動(dòng)子的條件復(fù)制型腺病毒Ad-CXCR4-E1,感染人前列腺癌細(xì)胞LNCaP,PC-3和正常前列腺上皮細(xì)胞RWPE-1。Western blot檢測(cè)感染后細(xì)胞E1蛋白的表達(dá)。
10、感染后行細(xì)胞病變?cè)囼?yàn)、臺(tái)盼藍(lán)染色、MTT、結(jié)晶紫染色法及流式細(xì)胞學(xué)檢測(cè),評(píng)估重組腺病毒對(duì)前列腺癌細(xì)胞生長(zhǎng)及殺傷的影響。
結(jié)果:質(zhì)粒酶切鑒定及PCR結(jié)果證實(shí)成功構(gòu)建了含有CXCR4啟動(dòng)子和E1區(qū)基因的條件復(fù)制型腺病毒載體Ad-CXCR4-E1,Western blot結(jié)果顯示感染Ad-CXCR4-E1后在高表達(dá)CXCR4的前列腺癌細(xì)胞中E1表達(dá)明顯增高,而在正常前列腺上皮細(xì)胞中,不能檢測(cè)到E1的表達(dá)。細(xì)胞病變?cè)囼?yàn)、臺(tái)盼藍(lán)染色、M
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