rPB-DR(6)調(diào)控的溶瘤腺病毒對(duì)前列腺癌細(xì)胞的殺傷作用研究.pdf

1、背景與目的:
　　前列腺癌是常見(jiàn)的男性惡性腫瘤之一,晚期前列腺癌經(jīng)抗雄激素治療6~18個(gè)月后,80％進(jìn)展為雄激素非依賴性前列腺癌(AIPC),至今還沒(méi)有能治愈AIPC的療法。目前針對(duì)AIPC治療的實(shí)驗(yàn)研究也進(jìn)展緩慢,尚無(wú)明顯突破。因此,探索新的治療方法以走出目前AIPC治療的困境是非常有必要的。
　　基于溶瘤腺病毒的病毒-基因治療成為腫瘤治療研究熱點(diǎn),為AIPC的治療提供了一種可行的方法。我們?cè)谇捌趯?shí)驗(yàn)中以rPB為基礎(chǔ)構(gòu)建了

2、rPB-DR(6)啟動(dòng)子,該啟動(dòng)子保持了前列腺組織特異性,同時(shí)可以對(duì)維甲酸-維甲酸受體復(fù)合物起反應(yīng)。由于所有的前列腺癌均表達(dá)維甲酸受體,在維甲酸存在時(shí),rPB-DR(6)啟動(dòng)子可特異性地在所有類型的前列腺癌細(xì)胞(包括AIPC)中起作用,驅(qū)動(dòng)下游基因表達(dá),故該啟動(dòng)子可用于構(gòu)建針對(duì)AIPC的溶瘤腺病毒。因此本研究擬制備rPB-DR(6)調(diào)控的溶瘤腺病毒,同時(shí)使其攜載自殺基因胞嘧啶脫氨酶(CD)進(jìn)一步增強(qiáng)抗腫瘤作用,觀測(cè)其對(duì)包括AIPC在內(nèi)的

3、前列腺癌細(xì)胞的殺傷作用。
　　方法:
　　以pUC119-rPB-DR(6)和pCD2為模板,PCR法擴(kuò)增出rPB-DR(6)啟動(dòng)子和CD基因,將rPB-DR(6)啟動(dòng)子插入到腺病毒早期基因E1A之前,同時(shí)插入mCMV啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的CD基因,構(gòu)建出重組質(zhì)粒p55-rPB-DR(6)-mCMV-CD(簡(jiǎn)寫(xiě)為p55-rPC),鑒定后將質(zhì)粒p55-rPC與腺病毒骨架質(zhì)粒pPE3共轉(zhuǎn)染293細(xì)胞并包裝出重組溶瘤腺病毒Ad5-rPB-D

4、R(6)-mCMV-CD,簡(jiǎn)稱Ad5-rPC,擴(kuò)增、純化并測(cè)定滴度。采用Ad5-rPC感染雄激素依賴和非依賴性前列腺癌細(xì)胞,Western Blot檢測(cè)病毒早期基因E1A和自殺基因CD蛋白表達(dá)水平,TCID50法檢測(cè)重組腺病毒Ad5-rPC感染癌細(xì)胞細(xì)后的復(fù)制能力,并應(yīng)用CCK-8法檢測(cè)重組病毒Ad5-rPC對(duì)前列腺癌細(xì)胞的特異性殺傷能力。
　　結(jié)果:
　　經(jīng)酶切、PCR及測(cè)序鑒定證實(shí)成功構(gòu)建了包含rPB-DR(6)啟動(dòng)子和

5、CD基因的重組溶瘤腺病毒Ad5-rPC,制備的重組溶瘤腺病毒Ad5-rPC滴度為1.1×1011pfu/mL。Ad5-rPC病毒感染前列腺癌細(xì)胞,Western Blot法檢測(cè)到E1A和CD蛋白陽(yáng)性表達(dá)。Ad5-rPC感染前列腺癌細(xì)胞系產(chǎn)生的子代病毒滴度均大于3.0×106pfu/mL,CCK-8法證實(shí)重組腺病毒對(duì)雄激素依賴性和非依賴性前列腺癌細(xì)胞均具有特異性殺傷能力,殺傷能力均大于65%。
　　結(jié)論:
　　(1)成功制備了