低氧下miR-96在前列腺癌細胞自噬調(diào)控中的作用.pdf

1、背景及目的:
　　低氧幾乎是所有實體腫瘤的重要微環(huán)境之一，而自噬是低氧誘導(dǎo)的細胞自我保護機制。近年研究發(fā)現(xiàn)自噬在前列腺癌進展中發(fā)揮重要作用，然而在前列腺癌中關(guān)于低氧調(diào)控自噬的機制尚不清楚。本研究擬闡明低氧通過microRNA調(diào)控自噬的具體機制及其在前列腺癌細胞增殖、凋亡和細胞周期調(diào)控中的作用。
　　材料與方法:
　　本研究涉及的生物材料包括3種前列腺癌細胞系：LNCaP、22Rv1和LAPC4；裸鼠30只；人前列腺癌組

2、織20份。本研究核酸檢測采用總RNA抽提（Trizol）后qPCR，蛋白水平檢測采用Western Blot、免疫熒光等。細胞活率檢測采用CCK-8，凋亡檢測采用流式細胞儀、Western Blot和活性CASP3染色，細胞周期檢測采用DAPI染色后高內(nèi)涵篩選系統(tǒng)分析。microRNA的靶基因驗證采用雙熒光素酶報告檢測、qPCR和Western Blot。形態(tài)學觀察采用激光共聚焦顯微鏡和高內(nèi)涵篩選系統(tǒng)。質(zhì)粒或microRNA轉(zhuǎn)染采用化學

3、轉(zhuǎn)染法，瞬轉(zhuǎn)。分析組間差異使用t檢驗或方差分析。皮爾森相關(guān)檢驗用于檢測miR-96與其靶基因表達之間的關(guān)系。數(shù)據(jù)分析使用SPSS16.0和GraphPad-Prism5進行。使用Adobe Illustrator CS6繪制模式圖，使用Microsoft Office Excel2007繪制熱圖。所有檢驗均為雙側(cè)，且當p<0.05時認為有統(tǒng)計學意義。
　　結(jié)果:
　　低氧在前列腺癌細胞中上調(diào)has-miR-96-5p（miR

4、-96），miR-96通過靶向作用于MTOR促進自噬，而使用miR-96 inhibitors抑制miR-96后可抑制自噬的發(fā)生。然而，當采用miR-96 mimics過表達miR-96并超過一定的閾值后，低氧誘導(dǎo)的自噬卻被抑制。進一步的研究發(fā)現(xiàn)，大劑量的miR-96可通過抑制自噬通路的關(guān)鍵因子 ATG7進而抑制自噬的發(fā)生。此外在本研究中，我們確定了miR-96調(diào)控自噬的閾值，并發(fā)現(xiàn)在該閾值兩側(cè)miR-96調(diào)控自噬的作用是相反的：在閾值

5、下方，miR-96通過抑制MTOR促進自噬流；而在閾值上方，miR-96通過抑制ATG7抑制自噬流。上述結(jié)果表明miR-96靶向MTOR或ATG7對自噬的影響取決于細胞內(nèi)miR-96的表達量。
　　上述這種 miR-96對自噬的雙向調(diào)控還影響到體外低氧環(huán)境下前列腺癌細胞的存活、增殖、凋亡和細胞周期水平，以及體內(nèi)前列腺癌移植瘤的生長。此外，我們檢測了人前列腺癌組織中 miR-96、ATG7和MTOR的表達量，并分析了miR-96表達

6、量和前列腺癌 WHO臨床分級之間的相關(guān)性。結(jié)果發(fā)現(xiàn) miR-96與ATG7和MTOR的表達量均表現(xiàn)為負相關(guān)（p<0.05），且miR-96表達量和前列腺癌WHO臨床分級之間存在相關(guān)性，組間差異明顯（p<0.05）。
　　結(jié)論:
　　上述結(jié)果表明在前列腺癌中，低氧誘導(dǎo)的自噬至少部分是通過miR-96來進行調(diào)控的。根據(jù)細胞內(nèi)miR-96不同的表達量，miR-96可通過主要抑制MTOR或ATG7來促進或抑制自噬。本研究在前列腺癌中