miR-218在前列腺癌細胞的擴散和侵襲過程中的作用機制研究.pdf

1、前列腺癌(Prostate Cancer，PCa)是男性患者中最常見的因?qū)嵭云鞴賽盒阅[瘤和癌癥而致死亡的第二個主要原因。根據(jù)長期大量的流行病學等研究，前列腺腫瘤的發(fā)生、發(fā)展主要受雄激素以及飲食習慣等綜合因素的影響。而長期慢性炎癥的刺激會導致人類罹患癌癥的風險大大增加，患癌的風險比正常人增加約20％，這其中包括胃癌、胰腺癌、結(jié)腸癌和肺癌。流行病學研究和組織病理學證據(jù)表明，PCa的發(fā)生率也與炎癥相關(guān)，但是其具體的機制，至目前仍不完全被人類所

2、認知?；旧?，由慢性炎癥最先創(chuàng)建一個環(huán)境，豐富的炎癥反應(yīng)可能會導致不受控制的細胞因子和生長因子增殖反應(yīng)和快速分裂的基因突變的單元格。因此，PCa是與炎癥密切相關(guān)特別是與炎癥因子的作用。
　　白細胞介素是人類體內(nèi)廣泛存在的炎癥細胞因子，其種類繁多。而白細胞介素-6(IL-6)是一款多功能炎癥因子。研究表明，細胞因子的表達及功能改變與人類的所患惡性腫瘤息息相關(guān)。白細胞介素-6也已被認定其在PCa患者的臨床標本中表達和Pca細胞株中廣泛

3、存在。
　　G蛋白偶聯(lián)受體(GPCR)48，也被稱為富含亮氨酸重復包含GPCR(LGR)4，其是一種糖蛋白激素受體，屬于GPCR家族，并在其GPCR家族中扮演重要角色。一般情況下，LGR4將編碼GPCR偶聯(lián)蛋白之一。一項最近的研究發(fā)現(xiàn)白細胞介素-6增強LGR4蛋白在骨肉瘤細胞的表達，表明LGR4可能影響白細胞介素-6基因在腫瘤表達。此外，臨床前和臨床研究已經(jīng)證實，GPCR在PCa組織組織中高表達。
　　LGR4的表達與多種類

4、型的癌癥的發(fā)生相關(guān)，包括肺癌、乳腺癌、前列腺癌和胃癌，以及肝癌的形成。LGR4對腫瘤的影響已認識到，但目前卻對LGR4表達的調(diào)節(jié)機制目前尚不清楚。
　　小分子RNA(miRNA)是一套內(nèi)源性小非編碼RNA（19-22堿基的長度）。和調(diào)節(jié)基因翻譯、表達或裂解以及RNA序列的特異性相關(guān)。大量證據(jù)表明，miRNA調(diào)節(jié)不同生物過程，包括細胞增殖、侵襲、遷移和細胞凋亡。miRNA下調(diào)多個靶基因，包括原癌基因和抑癌基因，同時一些miRNA功能

5、作為腫瘤抑制因子和其他基因一起充當原癌基因。特別是，miR-218，在有關(guān)miRNA抑制腫瘤發(fā)展的研究中，其已被廣泛認為與研究的幾種類型癌癥高度相關(guān)，在前列腺癌中同樣存在。在本研究中，我們即是想探討LGR4作為miR-218的下位靶點，其是如何通過調(diào)控LGR4影響PCa細胞增殖和侵襲的。
　　目的：
　　（一）分別采用實時熒光定量PCR法和ELISA法檢測miR-218和IL-6在癌旁正常組織(NP)、良性前列腺增生組(BP

6、H)、前列腺癌組織的表達水平。
　?。ǘ┙⒘艘粋€在IL-6低濃度下長期孵育的LNCaP-IL-6細胞亞系，采用實時熒光定量PCR法檢測miR-218在LNCaP和LNCaP-IL-6細胞傳代過程中的表達水平趨勢。采用BrdU和Transwell法對IL-6和miR-218在LNCaP-IL-6細胞系的影響進行統(tǒng)計分析。
　　（三）采用Western blot analysis法檢測IL-6和miR-218在LNCaP-I

7、L-6+細胞中對于LGR4蛋白表達的影響。
　　方法：
　　1.1病例選擇:選取2012年7月至2015年7月在我院診治的經(jīng)確診的58例前列腺癌患者的癌組織標本(Pca)、51例前列腺癌患者的癌旁正常組織標本(NP）、以及56例良性前列腺增生(BPH)患者的前列腺組織，同時均保存在-80℃冰箱內(nèi)。所有患者均經(jīng)入組標準篩選為確診病例。
　　1.2排除標準:已經(jīng)接受了內(nèi)分泌或其他治療的患者被排除。
　　1.3實驗方法

8、:分別采用實時熒光定量PCR法和ELISA法檢測miR-218和 IL-6在癌旁正常組織(NP)、良性前列腺增生組(BPH)、前列腺癌組織(Pca)的表達水平;建立了一個在IL-6低濃度下長期孵育的LNCaP-IL-6細胞亞系，采用實時熒光定量PCR法檢測miR-218在LNCaP和LNCaP-IL-6細胞傳代過程中的表達水平趨勢;采用BrdU和Transwell法對IL-6和miR-218在LNCaP-IL-6細胞系的影響進行統(tǒng)計分析

9、;采用Western blot analysis檢測IL-6和miR-218在LNCaP-IL-6細胞中對于LGR4蛋白表達的影響。
　　1.4統(tǒng)計學方法:定量資料采用統(tǒng)計學軟件SPSS20.0進行統(tǒng)計分析，測定結(jié)果以x±s表示，對RT-PCR各組數(shù)據(jù)采用單因素方差分析，以P＜0.05差異為有統(tǒng)計學意義。
　　結(jié)果：
　?。ㄒ唬﹎iR-218和IL-6在各組織中的表達水平
　　1.miR-218在癌旁正常組織(N

10、P)、良性前列腺增殖組織(BPH)、前列腺癌組織(Pca)的表達水平依次降低，分別為(1.49±0.07)、(0.89±0.02)、(0.51±0.02)，差異顯著(P=0.012)、(P=0.024)、((P=0.001)具有統(tǒng)計學意義。
　　2.IL-6在癌旁正常組織(NP)、良性前列腺增殖組織(BPH)、前列腺癌組織(Pca)的水平依次升高，分別為(1.09±0.05)、(1.89±0.01)、(2.52±0.02)，差異顯

11、著(P=0.002)、(P=0.004)、((P=0.020)具有統(tǒng)計學意義。
　　（二）在LNCaP-IL-6細胞亞系中，長期IL-6的刺激后，LNCaP細胞中miR-218表達水平下降，結(jié)果說明miR-218的表達在LNCaP轉(zhuǎn)化為LNCaP-IL-6+細胞的過程中逐漸下降。
　　（三）miR-218阻礙IL-6誘導的LNCaP-IL-6細胞的增殖和侵襲。BrdU分析結(jié)果表明IL-6促進LNCaP-IL-6細胞增殖，然而

12、miR-218轉(zhuǎn)染抑制了該作用。并且IL-6導致細胞周期中G0/G1期的細胞比例減少，相反mi-R218轉(zhuǎn)染促進G0/G1期數(shù)目細胞的增加。Transwell的結(jié)果顯示，LNCaP-IL-6細胞的侵襲能力在使用IL-6后顯著升高，然而這一作用被miR-218的轉(zhuǎn)染顯著抑制。
　?。ㄋ模￤estern blot analysis法檢測分別受到IL-6和miR-218影響的LNCaP-IL-6+細胞中LGR4蛋白表達水平:LGR4在I

13、L-6誘導的LNCaP-IL-6細胞中相對表達量為(2.20±0.30); LGR4在miR-218誘導的LNCaP-IL-6細胞中相對表達量為(0.40±0.01); LGR4在IL-6+miR-218誘導的LNCaP-IL-6細胞中相對表達量為(1.30±0.21);三者之間比較，差異均具有統(tǒng)計學意義。
　　（五）RT-PCR法檢測miR-218在miR-218轉(zhuǎn)染后的LNCaP-IL-6+細胞系中的表達水平:在miR-218

14、轉(zhuǎn)染組miR-218的相對表達量為(1.20±0.20)，與對照組相比顯著增加，差異具有統(tǒng)計學意義。
　　（六）Western blot analysis法LGR4蛋白在miR-218轉(zhuǎn)染后的LNCaP-IL-6+細胞系中的表達水平:在miR-218轉(zhuǎn)染組LGR4蛋白的相對表達量為(0.30±0.03)，與對照組相比顯著下降，差異具有統(tǒng)計學意義。
　　結(jié)論：
　?。ㄒ唬┰谇傲邢侔┑牟〕讨衜iR-218的表達下調(diào)，IL-

15、6的表達上調(diào)。熒光定量PCR結(jié)果示:BPH患者miR-218的表達較正常前列腺偏低，在前列腺癌患者的表達較BPH患者偏低。然而，ELISA結(jié)果顯示IL-6水平在正常、BPH、前列腺癌患者中趨勢與上述相反。長期IL-6的刺激后，LNCaP細胞中miR-218表達水平下降，結(jié)果說明miR-218的表達在正常前列腺、BPH、前列腺癌的進程中和LNCaP轉(zhuǎn)化為LNCaP-IL-6細胞的過程中逐漸下降，而IL-6逐漸升高。
　?。ǘ㎝iR

16、-218阻礙IL-6誘導的LNCaP-IL-6細胞的增殖和侵襲。BrdU分析結(jié)果表明IL-6促進LNCaP-IL-6細胞增殖，然而miR-218轉(zhuǎn)染抑制了該作用。統(tǒng)計分析表明IL-6導致細胞周期中G0/G1期的細胞比例減少，相反mi-R218轉(zhuǎn)染促進G0/G1期數(shù)目細胞的增加，LNCaP-IL-6細胞的侵襲能力在使用IL-6后顯著升高，然而這一作用被miR-218的轉(zhuǎn)染顯著抑制。
　?。ㄈ㎝iR-218抑制IL-6誘導的LNCa

17、P-IL-6細胞中LGR4的表達。結(jié)果顯示LGR4在LNCaP-IL-6細胞中經(jīng)IL-6預處理后顯著增加，然而miR-218準然后完全抑制了以上變化
　?。ㄋ模㎝iR-218通過結(jié)合在LGR43'-UTR靶點發(fā)揮作用。生物信息預測顯示在miR-218和LGR4的3'-UTR之間存在一個可能的結(jié)合位點。為了證實這個靶點，我們進行了熒光素酶報告基因分析，去評估被MIR-LGR4-UTR質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的HEK293T細胞的螢光素酶活性，并與轉(zhuǎn)