OD1啟動子上調(diào)多肽篩選體系的建立.pdf

1、超氧化物岐化酶(super oxide dismutase，SOD)是一種廣泛存在于生物體內(nèi)的金屬酶，根據(jù)分布的不同主要分為SOD1(Cu/Zn SOD，主要分布于真核細胞胞漿)，SOD2(Mn/Fe SOD，主要分布于真核細胞線粒體和原核細胞)和SOD3(EC-SOD，主要分布于細胞外基質(zhì))，不同的SOD均有催化超氧陰離子自由基O2-發(fā)生歧化反應的功能，是體內(nèi)重要的氧自由基清除劑。其中，SOD1是發(fā)現(xiàn)最早，研究最廣泛的一類。
　

2、　 氧自由基是直接或間接由分子氧轉(zhuǎn)化而成，外層軌道具有未配對電子的一類化學分子，包括超氧離子自由基、羥自由基、過氧化氫等。它們具有活潑的化學活性，極易發(fā)生得到或失去電子的反應，從而引發(fā)鏈式自由基反應。體內(nèi)的氧自由基包括由于高溫、輻射等原因?qū)е履承┖醴肿庸矁r鍵斷裂而產(chǎn)生的外源性自由基和體內(nèi)各種代謝過程中產(chǎn)生的內(nèi)源性氧自由基。氧自由基是機體代謝正常的中間產(chǎn)物，低濃度的氧自由基是機體執(zhí)行正常生理功能所必需，但在氧自由基異常增多或機體抗氧化

3、能力下降的情況下，氧自由基將通過鏈式自由基反應損傷細胞膜、DNA、蛋白質(zhì)等多種細胞組分。目前己知氧自由基與衰老、炎癥、缺血再灌注損傷、神經(jīng)退行性病變等多種疾病相關(guān)，清除多余的氧自由基對延長動物壽命，增強其對氧應激的承受能力和改善炎癥狀況等多個方面具有顯著的作用。
　　 機體主要通過兩階段的反應來清除體內(nèi)的氧自由基：第一階段是超氧陰離子自由基在SOD的作用下轉(zhuǎn)變?yōu)檠鯕夂瓦^氧化氫；第二階段是過氧化氫在過氧化氫酶(catalase，C

4、AT)的作用下轉(zhuǎn)變?yōu)樗脱鯕?。SOD在氧自由基的清除過程中起著至關(guān)重要的作用。SOD缺陷的大腸桿菌將無法在有氧條件下生存，而適量增加的SOD則能起到減少細胞內(nèi)氧自由基含量，減輕脂質(zhì)體過氧化乃至延緩衰老、控制炎癥等多種作用。可見，通過控制SOD在體內(nèi)的含量，可以調(diào)節(jié)氧自由基的濃度并從而改變多種相關(guān)的病理、生理狀態(tài)，具有極其重要的臨床意義。
　　 皮膚皺紋的產(chǎn)生機制包括外源性因素和內(nèi)源性因素兩個方面。外源性因素主要有日光照射所致的光

5、老化和其他環(huán)境因素如外傷、感染、空氣污染等對皮膚的損傷；內(nèi)源性因素主要有年齡增長導致的基因調(diào)控變化、內(nèi)源性自由基對細胞的損傷和機體代謝的紊亂。目前國際上主要針對光老化和內(nèi)源性氧自由基對皮膚的損傷這兩個方面進行抗皺研究。光老化指日光長期照射所致的皮膚老化，日光中的紫外線可通過產(chǎn)生高度反應的外源性氧自由基損傷皮膚。此外，紫外線最早損傷的部位為調(diào)節(jié)SOD和過氧化氫酶的基因，使二者合成減少，致使氧自由基聚集而損傷細胞。由上述可見，在皮膚皺紋產(chǎn)生

6、的內(nèi)源性和外源性途徑中，過高濃度的氧自由基都扮演著重要角色。因此，清除體內(nèi)過高的氧自由基對于皮膚抗皺具有重要的意義。如果能適度提高皮膚細胞內(nèi)SOD含量，則可以通過減少氧自由基的含量來減少對皮膚的損傷，從而保護皮膚，減少皺紋。
　　 雖然針對SOD的研究已有多年，但目前還沒有能夠?qū)嶋H進入臨床應用的SOD類藥物，這是因為SOD作為一種蛋白質(zhì)藥物，具有制備價格昂貴，不能直接進入細胞發(fā)揮作用、半衰期短、易誘發(fā)免疫反應等缺陷，且具體使用劑

7、量也不易控制。目前針對SOD藥用方面的研究主要包括研究藥物載體、發(fā)現(xiàn)SOD的小分子替代物和尋找能上調(diào)內(nèi)源性SOD表達藥物等途徑，據(jù)此，我們設計了一個利用報告基因技術(shù)篩選具有上調(diào)內(nèi)源性SOD1表達的隨機多肽篩選系統(tǒng)，試圖同時克服上述多種問題。
　　 報告基因是指其表達產(chǎn)物易被檢測且易與內(nèi)源性背景蛋白相區(qū)別的基因。通過將特定基因的轉(zhuǎn)錄控制元件克隆到報告基因載體，可以通過報告基因的表達來直觀地檢測目標基因的表達情況。紅色熒光蛋白(re

8、d fluorenscent protein，RFP)是一種分子量為28 kD的熒光蛋白，可自動發(fā)射熒光、無需任何輔助因子和底物的參與，且無需裂解細胞即可檢測活體組織和細胞的基因表達，作為報告基因具有其特有的優(yōu)越性。
　　 本研究利用基因重組技術(shù)構(gòu)建了含人SOD1啟動子區(qū)的紅色熒光蛋白報告基因質(zhì)粒，并通過轉(zhuǎn)染和抗生素篩選技術(shù)得到了能穩(wěn)定表達該質(zhì)粒的細胞系。此細胞系在適宜濃度的SODl誘導劑卟啉醇肉豆蔻酸乙酸酯(phorbol m

9、yristateacetate，PMA)刺激下，紅色熒光蛋白表達明顯增加，紅色熒光強度在一定范圍內(nèi)呈線性增長。這為篩選具有內(nèi)源性SOD1表達上調(diào)功能的藥物提供了一個方便、靈敏的工具。
　　 為了克服蛋白質(zhì)大分子常具有的免疫原性，我們使用連續(xù)的十二個隨機氨基酸組成的多肽作為篩選的對象。由于細胞膜具有選擇性通透性，大部分蛋白質(zhì)分子無法直接進入細胞內(nèi)部發(fā)揮生理學效應。我們選用Ⅰ型人類免疫缺陷病毒(human immunodeficie

10、ncy virus I，HIV-I)Tat蛋白的蛋白轉(zhuǎn)導域(proteintransduction domain，PTD)作為攜帶多肽入胞的載體。HIV-Tat是一種以非傳統(tǒng)內(nèi)吞途徑、非能量依賴，非受體介導方式直接穿透細胞膜進入細胞的多肽，它能攜帶多種不同大小和性質(zhì)的生物活性物質(zhì)如核苷酸、多肽、蛋白質(zhì)等進入細胞，是一種理想的多肽轉(zhuǎn)運載體。此外，融合蛋白中的增強型綠色熒光蛋白(enhanced green fluorescent prot

11、ein，EGFP)可作為蛋白入胞的指示劑，提示隨機多肽在細胞內(nèi)的分布情況。針對肽庫的容量性和多樣性問題，我們利用點突變技術(shù)引入36個隨機堿基，形成隨機表達文庫，其理論容量達到2012，從而保證了隨機多肽庫的容量性和多樣性。
　　 為了能夠進行高通量的多肽篩選，我們總結(jié)出一套切實可行的蛋白純化及藥物篩選流程。利用融合蛋白上的His標簽純化融合蛋白，將純化后的融合蛋白與穩(wěn)定表達報告基因質(zhì)粒的細胞孵育一定時間后，融合蛋白進入細胞，通過