中間偃麥草天冬氨酸蛋白酶基因TiAP1的功能分析.pdf

1、小麥?zhǔn)俏覈N植最廣泛的農(nóng)作物之一，全球大約1/3的人口以小麥為主食。但是，小麥白粉病和赤霉病一直是影響小麥高產(chǎn)、穩(wěn)產(chǎn)的重要限制因素。因此，挖掘新的抗病基因，培育出含有多個(gè)抗病基因聚合的抗病小麥品種是目前亟待解決的問題。
　　在前期研究中，從小偃麥異附加系SN6306（高感白粉的小麥品種煙農(nóng)15與中間偃麥草雜交后代）中克隆到了一個(gè)與白粉病抗性相關(guān)的天冬氨酸蛋白酶基因TiAP1。本研究以天冬氨酸蛋白酶基因TiAP1為研究對(duì)象，對(duì)TiA

2、P1基因的功能及作用機(jī)制進(jìn)行分析，主要結(jié)果如下：
　?。?）TiAP1蛋白的生物信息學(xué)分析
　　目的蛋白為天冬氨酸蛋白酶，通過對(duì)跨膜螺旋進(jìn)行預(yù)測(cè)，發(fā)現(xiàn)目的蛋白沒有跨膜結(jié)構(gòu)，因此不是跨膜蛋白。同時(shí)對(duì)蛋白的許多物理化學(xué)特性進(jìn)行了分析，目的蛋白含有506個(gè)氨基酸，等電點(diǎn)為5.6，含有信號(hào)肽，信號(hào)肽的切割位點(diǎn)位于第16和17個(gè)氨基酸之間。除此之外還對(duì)蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)和三級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行了預(yù)測(cè)，該蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)中延伸鏈和無規(guī)則卷曲所占的比例較

3、高，三級(jí)結(jié)構(gòu)構(gòu)建的模型比較穩(wěn)定。
　　（2）原核表達(dá)系統(tǒng)進(jìn)行蛋白質(zhì)的功能分析
　　利用本實(shí)驗(yàn)室現(xiàn)有的 pET-28a載體與密碼子優(yōu)化后的目的序列構(gòu)建原核表達(dá)載體pET-AP，重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入BL21中，加入IPTG誘導(dǎo)大腸桿菌表達(dá)，37℃誘導(dǎo)過夜，利用SDS-PAGE電泳，在45KD附近出現(xiàn)了目的條帶。利用Western blot對(duì)目的蛋白進(jìn)行檢測(cè)，證明誘導(dǎo)表達(dá)成功。利用親和層析，在將目的蛋白分離純化出來的過程中，發(fā)現(xiàn)目的蛋白表

4、達(dá)是以包涵體的形式。將目的蛋白純化復(fù)性后進(jìn)行白粉病菌孢子和赤霉病菌孢子的萌發(fā)試驗(yàn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)目的蛋白會(huì)抑制白粉病菌和赤霉病菌的孢子的萌發(fā)，
　?。?）TiAP1蛋白作用機(jī)制分析
　　通過分生孢子萌發(fā)實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn) TiAP1蛋白可以影響白粉病菌和禾谷鐮刀菌分生孢子的萌發(fā)。為了進(jìn)一步確定目的蛋白的作用機(jī)制，將禾谷鐮刀菌的菌絲和分生孢子分別放入蛋白儲(chǔ)存液、低濃度（0.146mg/ml）蛋白、高濃度（0.291mg/ml）蛋白溶液中孵育

5、，孵育結(jié)束后，加入熒光染料 SYTOX Green，觀察。結(jié)果發(fā)現(xiàn)在蛋白儲(chǔ)存液中孵育之后的菌絲和分生孢子加入熒光染料之后也沒有熒光產(chǎn)生；經(jīng)過低濃度蛋白溶液孵育后的菌絲和孢子，在顯微鏡下菌絲和分生孢子帶有微弱的熒光；高濃度的蛋白溶液中熒光增強(qiáng)。以上結(jié)果說明TiAP1蛋白可以增加細(xì)胞膜的通透性。
　?。?）轉(zhuǎn)基因小麥對(duì)白粉病菌的抗性鑒定
　　本實(shí)驗(yàn)室前期研究中得到了轉(zhuǎn)基因BobWhite小麥，進(jìn)行小麥白粉病菌E09的苗期抗病性鑒

6、定，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因小麥植株葉片上的孢子數(shù)明顯少于對(duì)照。說明 TiAP1基因可能會(huì)延緩白粉病的侵染速度。此外，為了進(jìn)一步探究 TiAP1基因可能參與的抗白粉病的途徑，通過白粉病菌誘導(dǎo)，轉(zhuǎn)基因小麥中茉莉酸甲酯的標(biāo)記基因OPDA、PR10、COL1標(biāo)記基因跟0h和對(duì)照相比，表達(dá)量明顯上調(diào)，其中PR10的表達(dá)量上調(diào)最多，是0h的20倍左右。這些結(jié)果表明TiAP1基因可能參與了茉莉酸激素調(diào)節(jié)途徑。
　?。?）轉(zhuǎn)基因擬南芥對(duì)Pst DC3000響