棉花酪氨酸蛋白磷酸酶基因GhIBR5的分離及功能分析.pdf

1、植物與其他多細(xì)胞生物體存在明顯的差異，植物只能依靠高度敏感的應(yīng)答機(jī)制去適應(yīng)環(huán)境的變化，但它不能通過(guò)自身的運(yùn)動(dòng)來(lái)躲避惡劣的自然環(huán)境。當(dāng)植物受到各類(lèi)環(huán)境脅迫傷害之后，會(huì)激活一系列錯(cuò)綜復(fù)雜的防衛(wèi)反應(yīng)來(lái)抵御這些逆境脅迫，并調(diào)控相關(guān)基因的表達(dá)。蛋白磷酸酶（protein phosphatase, PP）和蛋白激酶（protein kinase, PK）調(diào)控蛋白質(zhì)的可逆磷酸化，這個(gè)過(guò)程在防衛(wèi)反應(yīng)中起到了關(guān)鍵性的作用。作為一種調(diào)控蛋白，蛋白磷酸酶參與

2、植物體內(nèi)逆境脅迫誘導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程。酪氨酸蛋白磷酸酶（protein tyrosine phosphatases, PTPs）作為一類(lèi)典型的蛋白磷酸酶，已被證實(shí)介入到植物響應(yīng)逆境脅迫的信號(hào)過(guò)程以及控制生長(zhǎng)發(fā)育的許多生理過(guò)程。棉花是關(guān)系國(guó)計(jì)民生的戰(zhàn)略物資，應(yīng)用分子生物學(xué)方法分離抗逆基因，培育抗逆棉花物種是當(dāng)代農(nóng)業(yè)研究的重要目標(biāo)。本研究中，我們以陸地棉（Gossypium hirsutum L.）（魯棉22）為材料，分離得到了一個(gè)PTPs家

3、族的IBR5基因，并且命名為GhIBR5。我們對(duì)該基因進(jìn)行了序列對(duì)比分析、蛋白亞細(xì)胞定位、表達(dá)特性分析及生物學(xué)功能鑒定，主要研究結(jié)果如下：
　?。?）該基因的cDNA序列全長(zhǎng)為1263bp，包括了816bp的開(kāi)放閱讀框（ORF）、182bp的5'非編碼區(qū)和265bp的3'非編碼區(qū)。該ORF編碼一個(gè)包含271個(gè)氨基酸殘基的多肽，通過(guò)預(yù)測(cè)得知它的分子量為30.205kDa，pI值為6.65。同源序列比對(duì)分析及蛋白聚類(lèi)分析表明，我們克隆

4、得到的這個(gè)基因是一個(gè)典型的PTPs基因。
　?。?）利用煙草葉片進(jìn)行瞬時(shí)表達(dá)后進(jìn)行亞細(xì)胞定位分析實(shí)驗(yàn)，我們發(fā)現(xiàn) GhIBR5定位在細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中，由此我們推測(cè)該基因同時(shí)在細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)中發(fā)揮一定的生物學(xué)功能。
　　（3）通過(guò)PlantCARE和PLACE分析GhIBR5的啟動(dòng)子序列，我們發(fā)現(xiàn)了一系列響應(yīng)環(huán)境脅迫的順式作用元件。qRT-PCR和Western blot實(shí)驗(yàn)證明，在低溫（4℃）、干旱（15％ PEG6000）、

5、機(jī)械損傷（Wounding）、茉莉酸甲酯（Methyl Jasmonate, MeJA）和赤霉素（Gibberellin, GA3）的處理下，GhIBR5的表達(dá)量上調(diào)；在高鹽、青枯勞爾氏菌（Ralstonia solanacearum, R. solanacearum）、立枯絲核菌（Rhizoctonia solani, R. Solani）和水楊酸（Salicylic acid, SA）的處理下，GhIBR5的表達(dá)量下調(diào)。我們推測(cè)Gh

6、IBR5可能響應(yīng)多種生物脅迫和非生物脅迫。
　　（4）我們得到了GhIBR5轉(zhuǎn)基因超表達(dá)的本生煙植株，進(jìn)行生物學(xué)功能分析后發(fā)現(xiàn)，在萌發(fā)期和成苗期GhIBR5基因超表達(dá)降低了植株對(duì)干旱的耐受性。另外，失水率分析發(fā)現(xiàn)對(duì)GhIBR5基因進(jìn)行超表達(dá)提高了植株對(duì)干旱脅迫的敏感性。
　?。?）立枯絲核菌侵染葉片之后，轉(zhuǎn)基因煙草的葉片上病斑面積更大，這說(shuō)明轉(zhuǎn)基因煙草降低了對(duì)立枯絲核菌的抗性。此外，我們利用病毒介導(dǎo)的基因沉默（Virus-i

7、nduced gene silencing, VIGS）技術(shù)獲得了棉花GhIBR5沉默植株，通過(guò)對(duì)其進(jìn)行抗病檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)沉默 GhIBR5基因提高了植株對(duì)立枯絲核菌的抗性。因此，GhIBR5基因可能響應(yīng)病原菌信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。
　?。?）干旱脅迫條件處理后通過(guò)DAB染色，發(fā)現(xiàn)超表達(dá)植株的葉片比野生型植株積累了較多的ROS，氧化損傷更嚴(yán)重。在沉默GhIBR5基因的植株中有更少的ROS的積累。干旱、立枯絲核菌條件處理后，轉(zhuǎn)基因煙草中 SOD