半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-1的活化在哮喘氣道炎癥中作用的研究.pdf

1、研究背景：支氣管哮喘（簡稱哮喘）是全球范圍內(nèi)常見的慢性呼吸道疾病，近年來在世界各國均有逐年上升的趨勢，已成為嚴(yán)重威脅人類健康的一類疾病。據(jù)統(tǒng)計(jì)，全球約有3億哮喘患者，全球患病率1％～18％，我國約有1000～3000萬哮喘患者，并有不斷增加的趨勢。哮喘是一種由基因與環(huán)境因素共同導(dǎo)致的復(fù)雜疾病。盡管哮喘基礎(chǔ)研究已取得較大的進(jìn)步，但目前發(fā)病機(jī)制和發(fā)展環(huán)節(jié)尚未完全明確，臨床上對(duì)于哮喘的急性加重以及重癥哮喘的治療亦不是很滿意。因此，探討哮喘氣道

2、炎癥發(fā)病機(jī)制、尋找新的治療或預(yù)防靶點(diǎn)是呼吸系統(tǒng)疾病研究重點(diǎn)和熱點(diǎn)。
　　 支氣管哮喘是一種以氣道慢性炎癥、粘液分泌增加、氣道重塑及氣道反應(yīng)性增高為主要特征的免疫變態(tài)反應(yīng)性疾病。其中，氣道炎癥為最主要的病理變化，并決定氣道阻塞和氣道高反應(yīng)性的程度。隨著研究的不斷拓展和深入，關(guān)于哮喘發(fā)病機(jī)制的假說不斷增多，得到最廣泛關(guān)注的是哮喘發(fā)病的“衛(wèi)生學(xué)假說”，其核心為Th1/Th2失衡。該學(xué)說認(rèn)為哮喘的發(fā)生是由于體內(nèi)Th1/Th2平衡失調(diào)所致

3、，即正常人以Th1/Th2保持平衡，但哮喘患者體內(nèi)則Th0向Th2分化過度，使Th2占優(yōu)勢。Th1/Th2失衡是哮喘發(fā)病的重要基礎(chǔ)，Th2優(yōu)勢是過敏性哮喘形成及進(jìn)展的關(guān)鍵性機(jī)制。除了炎癥細(xì)胞和炎癥介質(zhì)，氣道結(jié)構(gòu)細(xì)胞特別是氣道上皮細(xì)胞也參與氣道炎癥的發(fā)生與發(fā)展，氣道上皮細(xì)胞(HBE)首先作為氣道的第一道防線抵抗外來侵害，同時(shí)在氣道固有免疫中也發(fā)揮著重要作用(一)研究證明HBE是哮喘聯(lián)系固有免疫與獲得性免疫的橋梁。隨著對(duì)炎癥性疾病的深入研究

4、以及對(duì)炎癥通路的逐步了解，炎癥復(fù)合體(inflammasome)成為多種炎癥性疾病的研究重點(diǎn)，其中研究最多的就是NLRP3炎癥復(fù)合體。NLRP3(nucleotide-binding oligomerization domain-leucine-rich repeats containing pyrindomain3)炎癥復(fù)合體是由NLRP3蛋白、凋亡相關(guān)點(diǎn)樣蛋白(ASC)和Caspase-1組成的多蛋白復(fù)合體。NLRP3蛋白能通過AS

5、C接合半胱氨酸天冬氨酸酶-1前體pro-Caspase-1(45KDa)組裝成NLRP3炎癥復(fù)合體，組裝后的pro-Caspase-1能自動(dòng)激活形成有活性的Caspase-1，活化的Caspase-1(10KDa和20KDa)促進(jìn)IL-1家族細(xì)胞因子（IL-1β，IL-18，IL-33等）成熟與分泌，從而參與炎癥反應(yīng)。
　　 為了揭示NLRP3炎癥復(fù)合體組裝后激活的Caspase-1在哮喘氣道炎癥的作用機(jī)制，本研究選擇了C57B

6、L/6小鼠和人氣道上皮細(xì)胞(16HBE)作為研究對(duì)象，觀察在哮喘小鼠模型以及人氣道上皮細(xì)胞炎癥微環(huán)境中Caspase-1的表達(dá)，以及下游細(xì)胞因子IL-1家族細(xì)胞因子的生成，并通過Ac-YVAD-cmk阻斷Caspase-1活化觀察其是否可以引起IL-1家族細(xì)胞因子表達(dá)的改變，從而為完善哮喘氣道炎癥機(jī)制研究及治療方法上提供參考。
　　 第一部分小鼠哮喘模型建立
　　 目的：建立OVA致敏和激發(fā)雌性C57BL/6小鼠哮喘模型

7、。
　　 方法：SPF級(jí)雌性C57BL/6小鼠（南方醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心）18只，6-8周，體重18～20g，隨機(jī)分為3組，對(duì)照組（A組）、哮喘組（B組）和Caspase-1特異性抑制劑(Ac-YVAD-cmk)組（C組），B、C組小鼠于實(shí)驗(yàn)流程第0天、7天、14天給予腹腔注射雞卵蛋白(OVA)液200μl致敏，A組僅用生理鹽水替代致敏。B、C組小鼠于第21-27天霧化激發(fā)，給予2％ OVA40ml，經(jīng)超聲霧化器霧化吸入30mi

8、n，1次/天; C組每次激發(fā)前30min給予Ac-YVAD-cmk溶液5μg/g腹腔注射;對(duì)照組用生理鹽水代替OVA霧化激發(fā)。術(shù)次激發(fā)24h后，各組小鼠霧化吸入乙酰甲膽堿，用BUXCO無創(chuàng)肺功能檢測儀記錄氣道反應(yīng)性監(jiān)測指標(biāo)增強(qiáng)呼氣間歇(Penh)值。第29天采用水合氯醛麻醉小鼠，摘眼球放血處死，75％酒精消毒，行支氣管肺泡灌沈術(shù)，回收BALF，離心取細(xì)胞沉渣，重懸充板行細(xì)胞計(jì)數(shù);涂片，瑞氏染色，細(xì)胞分類計(jì)數(shù);取右上肺組織4％多聚甲醛固定

9、，酒精脫水，石蠟包埋，常規(guī)HE染色，光學(xué)顯微鏡下觀察組織形態(tài)，氣管和血管周圍炎癥細(xì)胞浸潤情況。
　　 結(jié)果：
　　 1.致敏、激發(fā)哮喘過程小鼠行為學(xué)觀察:B組、C組誘發(fā)哮喘后后出現(xiàn)不同程度呼吸急促、立毛、前肢搔鼻和煩躁不安，然后出現(xiàn)口唇紫紺、呼吸急促、二便失禁、活動(dòng)度減低等癥狀，而A組未見上述癥狀。
　　 2.無創(chuàng)肺功能檢測氣道反應(yīng)性結(jié)果:當(dāng)乙酰甲膽堿濃度為3.125g/L、12.5g/L、25g/L和50g/L

10、時(shí)，各組Penh值比較，B組明顯高于A組和C組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 3.BALF中細(xì)胞總數(shù)和嗜酸性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞百分比:①BALF細(xì)胞計(jì)數(shù):B組BALF細(xì)胞總數(shù)(28.43±3.45)×104/ml，高于A組（9.01±2.33）×104/ml和C組（22.89±4.61）×104/ml(F=46.682，P=0.000)。②BALF嗜酸性粒細(xì)胞百分?jǐn)?shù):B組嗜酸性粒細(xì)胞百分比為（22.35±4.91）％，明顯高于A組（1

11、.07±0.20）％和C組（13.58±2.13）％(F=71.916，P=0.000)。③BALF淋巴細(xì)胞百分?jǐn)?shù):B組淋巴細(xì)胞百分比為（32.32±6.12）％，明顯高于A組(10.76±2.02)％和C組（18.50±3.18)％(F=34.688,P=0.000)。
　　 4.肺組織病理學(xué)觀察:A組小鼠肺組織細(xì)支氣管和肺泡結(jié)構(gòu)清晰，未見明顯炎癥浸潤;B組小鼠細(xì)支氣管壁和周圍有大量炎癥細(xì)胞浸潤，主要為淋巴細(xì)胞，支氣管腔內(nèi)可見

12、粘液分泌，C組小鼠細(xì)支氣管壁和周圍可見炎癥細(xì)胞浸潤，杯狀細(xì)胞增生，但與哮喘組相比，支氣管和血管周圍炎癥明顯減輕。
　　 結(jié)論：雌性C57BL/6小鼠OVA聯(lián)合鋁劑腹腔注射致敏后，再用OVA霧化激發(fā)的方法成功建立小鼠哮喘模型，出現(xiàn)哮喘癥狀和氣道反應(yīng)性增加，符合哮喘氣道炎癥的病理生理改變。
　　 第二部分哮喘小鼠肺部Caspase-1表達(dá)和IL-1β、IL-33生成
　　 目的：觀察哮喘小鼠肺部Caspase-1表達(dá)

13、和下游細(xì)胞因子IL-1β、IL-33的成熟與分泌，探討可能的機(jī)制。
　　 方法：取3組動(dòng)物肺組織標(biāo)本各3份，1份采用Trizol試劑提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄為互補(bǔ)脫氧核糖核酸(cDNA)，以此為模板行PCR擴(kuò)增。采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR(real time quantitative-PCR)檢測Caspase-1 mRNA表達(dá)水平;1份加預(yù)冷的含蛋白酶抑制劑(PMSF)的RIPA裂解液，冰磨3～5min，離心取上清，BCA法測定蛋白含

14、量，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算蛋白濃度，SDS-PAGE電泳和免疫印記反應(yīng)，半干法轉(zhuǎn)膜，顯色，曝光，1mage J軟件分析;1份用預(yù)冷的PBS沖洗后濾紙吸干，稱重，剪刀剪碎后，加入PBS液，冰磨2min，離心取上清，BCA法測定蛋白含量，參照試劑盒說明書進(jìn)行IL-1β、IL-33的檢測。
　　 結(jié)果：
　　 1.小鼠肺組織中Caspase-1 mRNA的表達(dá):每個(gè)樣本的Caspase-1的相對(duì)mRNA表達(dá)水平直接用樣品各自管家基

15、因GAPDH的表達(dá)來標(biāo)準(zhǔn)化初始mRNA量。以2-ΔΔCt值比較，A組（2.12±1.33）和C組（5.99±4.20）均低于B組（15.97±8.67），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。(F=10.653，P=0.004)。
　　 2.小鼠肺組織Caspase-1蛋白的表達(dá):通過Image J軟件分析B組Caspase-1/β-actin（0.56±0.03）較A組(0.47±0.03)和C組（0.28±0.03）明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(

16、F=73.916，P=0.000)3.IL-1β和IL-33的分泌: B組肺組織勻漿上清IL-1β（76.49±9.43）pg/mg及IL-33（73.08±6.67）pg/mg含量均高于A組[(37.51±9.13)pg/mg，P＜0.05;(32.79±5.92)pg/mg, P＜0.05）和C組[(64.74±8.65)pg/mg, P＜0.05;(46.94±2.38)pg/mg, P＜0.05)。
　　 結(jié)論：Casp

17、ase-1活化及其下游IL-1家族細(xì)胞因子（IL-1β，IL-33）增加并參與哮喘氣道炎癥。
　　 第三部分脂多糖誘導(dǎo)人氣道上皮細(xì)胞Caspase-1表達(dá)
　　 研究目的：觀察LPS誘導(dǎo)人氣道上皮細(xì)胞過程中半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-1(Caspase-1)表達(dá)情況。
　　 方法：16HBE細(xì)胞復(fù)蘇后以RPMI-1640（含10％胎牛血清）為基本培養(yǎng)液，0.25％含EDTA的胰蛋白酶消化傳代，每周傳代2-3次。2×1

18、05/ml接種于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板培養(yǎng)24h后貼壁，用PBS液和無血清RPMI-1640培養(yǎng)基清洗，37℃，5％CO2培養(yǎng)箱中無血清RPMI-1640培養(yǎng)基培養(yǎng)，用LPS(10μg/ml)預(yù)先將16HBE細(xì)胞致敏，制備氣道上皮細(xì)胞哮喘模型，37℃、5％CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24h，PBS液為空白對(duì)照，LPS組加LPS（10μg/ml）培養(yǎng)24 h;LPS+組Caspase-1特異性抑制劑(Ac-YVAD-cmk)（以下簡稱LPS+cmk組）先用

19、Ac-YVAD-cmk（10μmol/L）預(yù)處理，1h后再加入LPS(10μg/ml)培養(yǎng)至24h。四氮唑鹽(MTT)法測定各組細(xì)胞增殖能力，RT-PCR檢查各組細(xì)胞Caspase-1 mRNA的表達(dá)，western blot檢測各組細(xì)胞Caspase-1蛋白表達(dá)，ELISA檢測各組細(xì)胞上清液中IL-1β的生成。
　　 結(jié)果：
　　 1.MTT檢測及OD值測定:三組人氣道上皮細(xì)胞MTT檢測及OD值測定。陰性對(duì)照組OD值為

20、0.57±0.10，LPS組OD值為0.54±0.06，LPS+cmk組OD值為0.51±0.08，各組OD值比較P＞0.05(P=0.611，F(xiàn)=0.520)，各組細(xì)胞增殖無顯著差異。
　　 2.各組細(xì)胞Caspase-1 mRNA的表達(dá):以2的-ΔΔCt次方比較，對(duì)照組（1.33±0.33）和LPS+cmk組（1.50±0.24）均低于LPS組（3.11±0.57），各組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=17.564，P=0.003)

21、。
　　 3.各組細(xì)胞Caspase-1蛋白的表達(dá):以灰度掃描結(jié)果（Z值）比較，LPS組為0.85±0.11，LPS+cmk組為0.48±0.06，對(duì)照組為0.24±0.03。LPS+cmk組與對(duì)照組Z值均小于LPS組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=55.158，P=0.000)。
　　 4.各組細(xì)胞上清液IL-1β含量變化:與LPS組[(52.34±2.47)pg/ml]相比，陰性對(duì)照組[(15.73±6.83)pg/ml]和