施毛蟲半胱氨酸蛋白酶抑制因子TsCystatin1的克隆、表達及鑒定.pdf

1、旋毛蟲是一種細胞內(nèi)寄生性線蟲,其生活史可以在同一宿主內(nèi)完成,宿主感染譜極廣,幾乎所有的哺乳動物均可感染。旋毛蟲感染引起的旋毛蟲病是一種危害極其嚴重的食源性人獸共患寄生蟲病。半胱氨酸蛋白酶抑制因子是一類廣泛存在于生物體的半胱氨酸蛋白酶高效內(nèi)源性抑制劑。寄生蟲半胱氨酸蛋白酶抑制劑在寄生蟲逃避宿主免疫應答、適應寄生生活中發(fā)揮著重要作用。寄生性線蟲半胱氨酸蛋白酶抑制劑具有明顯的免疫調(diào)控作用,在寄生蟲入侵宿主時對宿主免疫應答的抑制起重要作用,是誘

2、導宿主免疫抑制的重要因子之一。
　　 本研究根據(jù)旋毛蟲半胱氨酸蛋白酶抑制因子基因(TsCystatinl)EST序列設計引物為上游引物,以PolyT為下游引物對旋毛蟲新生幼蟲總RNA進行RT-PCR,克隆獲得具有完整開放閱讀框(ORF)的TsCystatinl cDNA序列。序列分析結果表明TsCystatinl基因開放閱讀框為669 bp,編碼221個氨基酸,具有典型的半胱氨酸蛋白酶抑制因子保守氨基酸序列。旋毛蟲基因組DNA分

3、析表明該基因由兩個外顯子和一個80 bp的內(nèi)含子組成。對旋毛蟲成蟲、新生幼蟲以及旋毛蟲感染不同時期的肌幼蟲分別進行RT-PCR和實時熒光定量PCR,結果表明該基因在旋毛蟲各個發(fā)育時期均有表達。將TsCystatinl基因克隆到原核表達載體pGEX-4T-1,構建了重組表達質(zhì)粒pGEX-4T-TsCystatinl,重組表達質(zhì)粒轉化大腸桿菌BL21后誘導表達,SDS-PAGE電泳分析表明,該基因在原核表達系統(tǒng)中得到了高效表達,產(chǎn)物分子量約