hS100A6對(duì)人骨肉瘤細(xì)胞株143B的作用及機(jī)制探討.pdf

1、研究背景和目的：
　　 腫瘤的發(fā)生發(fā)展是一個(gè)多因素作用、多基因參與、經(jīng)歷多個(gè)階段的復(fù)雜生物學(xué)過(guò)程，有許多信號(hào)分子參與其中。這些信號(hào)分子對(duì)腫瘤的作用、作用機(jī)制以及信號(hào)分子之間的相互關(guān)系均較復(fù)雜，尚待闡明。
　　 S100蛋白家族是一類具有EF-手形結(jié)構(gòu)的鈣結(jié)合蛋白信號(hào)分子，至少有25個(gè)成員。與鈣離子及其靶蛋白結(jié)合后發(fā)揮多種生理功能：參與細(xì)胞增殖和分化、調(diào)節(jié)鈣穩(wěn)態(tài)、蛋白質(zhì)磷酸化、酶活性及轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)節(jié)。現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)其中多個(gè)成員在

2、腫瘤中表達(dá)異常，并參與腫瘤發(fā)生發(fā)展。S100A6就是其中的一員，在多數(shù)上皮腫瘤、多數(shù)骨肉瘤、卵巢癌等多種腫瘤細(xì)胞中高表達(dá)，但是其對(duì)腫瘤的作用尚無(wú)定論。基于此，本課題擬進(jìn)一步研究S100A6對(duì)人骨肉瘤的體內(nèi)和體外作用。
　　 Wnt/β-catenin信號(hào)途徑是公認(rèn)的與腫瘤發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)的信號(hào)途徑，β-catenin是其關(guān)鍵的信號(hào)分子。胞漿中β-catenin增多后，可轉(zhuǎn)移到胞核，進(jìn)而與其相應(yīng)的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合，導(dǎo)致該信號(hào)途徑下游靶

3、基因的轉(zhuǎn)錄激活；這些靶基因（如c-myc、細(xì)胞周期素D1等）具有促進(jìn)細(xì)胞增殖和遷移等作用。β-catenin的高表達(dá)和該信號(hào)途徑的失調(diào)常見(jiàn)于大多數(shù)腫瘤，包括骨肉瘤。
　　 我們前期的研究發(fā)現(xiàn)：1）S100A6可以抑制人骨肉瘤細(xì)胞MG63和U20S的增殖和遷移；2）S100A6可以增加骨肉瘤細(xì)胞MG63和U20S中Wnt信號(hào)活性；3）Pull-down分析發(fā)現(xiàn)S100A6與Wnt信號(hào)途徑的多個(gè)成員，β-catenin、糖原合成酶激

4、-3β（glycogen synthasekinase，GSK-3β）和散亂蛋白DVL（dishevelled，DVL）之間有體外相互作用；同時(shí)，S100A6的高表達(dá)與β-catenin的增多和Wnt/β-catenin信號(hào)途徑的失調(diào)常常同時(shí)存在于骨肉瘤?；谏鲜?，我們推測(cè)：S100A6可能參與調(diào)節(jié)Wnt/β-catenin信號(hào)途徑的活性，并因此實(shí)現(xiàn)對(duì)骨肉瘤細(xì)胞的生物學(xué)作用。為驗(yàn)證此假設(shè)，本課題擬通過(guò)蛋白質(zhì)印跡法進(jìn)一步探討S100A6對(duì)

5、另一株人骨肉瘤細(xì)胞143B中β-catenin水平的影響和通過(guò)免疫共沉淀的方法進(jìn)一步確認(rèn)S100A6與Wnt/β-catenin信號(hào)途徑中主要成員之間直接相互作用的存在。
　　 同時(shí)，我們也擬通過(guò)酵母雙雜交技術(shù)探尋與S100A6存在相互作用的分子，為全面地了解S100A6對(duì)骨肉瘤的作用及機(jī)制提供新的線索。
　　 綜上，本課題擬通過(guò)重組腺病毒感染的方式分別轉(zhuǎn)入hS100A6基因及其siRNA基因，探討hS100A6對(duì)人骨肉

6、瘤細(xì)胞株143B細(xì)胞的體外作用（增殖、遷移和凋亡）和體外作用以及對(duì)該細(xì)胞中β-catenin的影響；通過(guò)免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation，Co-IP）方法，探討hS100A6與Wnt信號(hào)途徑的主要成員（β-catenin、GSK-3β、DVL和Axin）之間是否存在直接相互作用；同時(shí)，通過(guò)酵母雙雜交方法尋找人骨肉瘤細(xì)胞株143B細(xì)胞中與S100A6相互作用的分子，為闡明S100A6對(duì)骨肉瘤細(xì)胞的作用及可能機(jī)制積累

7、更翔實(shí)的實(shí)驗(yàn)依據(jù)，為發(fā)現(xiàn)骨肉瘤診斷和預(yù)后判斷的分子標(biāo)志物以及治療的新靶點(diǎn)奠定基礎(chǔ)。
　　 方法：
　　 1.利用HEK293細(xì)胞擴(kuò)增分別攜帶hS100A6基因、hS100A6的siRNA基因和β-catenin基因的重組腺病毒AdS100A6、AdsiS100A6和Adβ-catenin；也同樣方法擴(kuò)增它們的對(duì)照腺病毒（AdGFP和AdRFP）。
　　 2.通過(guò)重組腺病毒AdS100A6和AdsiS100A6分別

8、上調(diào)和下調(diào)人骨肉瘤細(xì)胞143B中S100A6的表達(dá)后，用MTT法和臺(tái)盼蘭染色活細(xì)胞計(jì)數(shù)法檢測(cè)細(xì)胞的增殖活性，Hoechst染色檢測(cè)細(xì)胞凋亡，Transwell小室檢測(cè)細(xì)胞的遷移能力。
　　 同時(shí)，在動(dòng)物荷瘤模型上觀察hS100A6對(duì)骨肉瘤的體內(nèi)作用。
　　 3.通過(guò)重組腺病毒AdS100A6和AdsiS100A6分別上調(diào)和下調(diào)人骨肉瘤細(xì)胞S100A6的表達(dá)后，Western Blot檢測(cè)β-catenin蛋白的表

9、　　 達(dá)。
　　 4.用Co-IP方法檢測(cè)S100A6與Wnt/β-catenin信號(hào)途徑的主要成員β-catenin、GSK-3β、DVL和Axin之間的直接相互作用。
　　 5.利用Clontech試劑盒構(gòu)建用于酵母雙雜交的143B細(xì)胞的cDNA文庫(kù)后，用酵母雙雜交方法尋找143B細(xì)胞中與S100A6相互作用的分子。
　　 結(jié)果：
　　 1.重組腺病毒感染的HEK293細(xì)胞中有相應(yīng)的綠色或紅色熒光蛋

10、白表達(dá)，在72 h時(shí)感染率約為90％；擴(kuò)增所獲病毒液的滴度為108-109pfu/ml。
　　 2.免疫細(xì)胞化學(xué)法證實(shí)：感染AdS100A6后的143B細(xì)胞中，S100A6的表達(dá)是實(shí)驗(yàn)對(duì)照組（AdGFP組）的1.19倍，而感染AdsiS100A6后的143B細(xì)胞中S100A6的表達(dá)僅為AdGFP組的61.2％，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。
　　 3.外源性hS100A6能抑制人骨肉瘤細(xì)胞株143B細(xì)胞的增殖和遷移

11、，并促進(jìn)細(xì)胞凋亡，同時(shí)能抑制人骨肉瘤細(xì)胞株143B的裸鼠皮下移植瘤的生長(zhǎng)，甚至轉(zhuǎn)移。
　　 4.用不同處理因素處理的等量人骨肉瘤細(xì)胞143B接種入裸鼠皮下，30天時(shí)處死，空白組、AdGFP組、AdS100A6組、AdsiS100A6組的瘤體體積分別為：2796±154 mm3、2876±263mm3、1716±120mm3、4520±400 mm3，空白組和AdGFP組間差異無(wú)顯著性（P>0.05），AdS100A6組、Adsi

12、S100A6組與對(duì)照組比較差異均具顯著性（P<0.01），兩實(shí)驗(yàn)組組間差異也具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。
　　 5.外源性hS100A6增加人骨肉瘤細(xì)胞143B中β-catenin表達(dá)。
　　 6.hS100A6與Wnt/β-catenin信號(hào)途徑主要成員β-catenin、GSK-3β和DVL之間存在直接相互作用；未檢測(cè)到與Axin之間的直接相互作用。
　　 7.成功構(gòu)建人骨肉瘤細(xì)胞株143B的酵母雙雜交c

13、DNA文庫(kù)
　　 8.成功構(gòu)建酵母雙雜交誘餌質(zhì)粒pGBKT7-S100A6
　　 9.運(yùn)用酵母雙雜交方法檢測(cè)143B細(xì)胞中與hS100A6存在相互作用的分子
　　 結(jié)論：
　　 1.外源性hS100A6能抑制人骨肉瘤細(xì)胞株143B細(xì)胞的增殖和遷移，并促進(jìn)細(xì)胞凋亡，同時(shí)能抑制人骨肉瘤細(xì)胞株143B的裸鼠皮下移植瘤的生長(zhǎng)，甚至轉(zhuǎn)移。
　　 2.hS100A6能夠增加人骨肉瘤細(xì)胞株143B的β-cate

14、nin表達(dá)；hS100A6可能是導(dǎo)致骨肉瘤中β-cmenin增加及Wnt/β-catenin信號(hào)途徑活性增強(qiáng)的機(jī)制之一。
　　 3.hS100A6與Wnt/β-catenin信號(hào)途徑主要成員β-catenin、GSK-3p和DVL之間存在直接相互作用，這可能是上調(diào)β-catenin及Wnt/β-catenin信號(hào)途徑活性的部分機(jī)制；未檢測(cè)到hS100A6與Axin之間的直接相互作用。
　　 4.成功構(gòu)建人骨肉瘤細(xì)胞株14

15、3B的酵母雙雜交cDNA文庫(kù)。
　　 5.成功構(gòu)建酵母雙雜交誘餌質(zhì)粒pGBKT7-S100A6。
　　 6.運(yùn)用酵母雙雜交方法檢測(cè)到2個(gè)陽(yáng)性克隆，其編碼基因分別與S100A6基因和pGBKCg載體序列的同源性高。尚待進(jìn)一步驗(yàn)證。
　　 7.基于上述，我們推測(cè)：hS100A6對(duì)骨肉瘤的抑制性作用可能是經(jīng)由其它信號(hào)途徑介導(dǎo)的；hS100A6同時(shí)激活這些抑制性信號(hào)途徑以及Wnt/β-catenin信號(hào)途徑，通過(guò)這些途徑