表達(dá)紅色熒光蛋白的人骨肉瘤143B原位模型的活體熒光成像及內(nèi)皮抑素聯(lián)合化療研究.pdf

1、研究背景:肉瘤是最常見的原發(fā)性高度惡性腫瘤之一，起源于間葉組織的惡性腫瘤稱為肉瘤，多發(fā)生于皮膚、皮下、骨膜及長(zhǎng)骨兩端，肉瘤生長(zhǎng)迅速，腫瘤晚期常有壞死、出血、切面灰紅色、質(zhì)均勻細(xì)如生魚肉狀，早期即可發(fā)生血行轉(zhuǎn)移。骨肉瘤是其中最常見的骨惡性腫瘤，大約占兒童惡性腫瘤的2.4％，10-20歲為骨肉瘤的發(fā)病的高峰期，好發(fā)于生長(zhǎng)活躍的干骺端，常見發(fā)病部位為股骨遠(yuǎn)端和脛骨近端。以能夠產(chǎn)生骨樣組織的梭形基質(zhì)細(xì)胞為特征，骨肉瘤發(fā)展迅速，病程短，開始在皮質(zhì)

2、內(nèi)生長(zhǎng)，可逐漸向骨髓腔發(fā)展，有時(shí)向外突破骨膜，侵入周圍軟組織間葉組織的惡性腫瘤，并且多數(shù)于疾病早期出現(xiàn)肺部遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，目前，約有80％的骨肉瘤患者被認(rèn)為存在肺轉(zhuǎn)移，但是目前經(jīng)檢測(cè)手段檢查僅能發(fā)現(xiàn)8-15％。多數(shù)骨肉瘤病人都有高致殘率且預(yù)后不良。近年來(lái)，雖然骨肉瘤新輔助化療方案巳取得一些突破性進(jìn)展，但由于肉瘤發(fā)病因素的多樣性和癌細(xì)胞的復(fù)雜性，不少患者預(yù)后不佳，所以骨肉瘤的治療仍然是個(gè)復(fù)雜的問題。
　　 目的:一、探索出建立穩(wěn)定標(biāo)記的

3、人骨肉瘤143B細(xì)胞系裸鼠原位骨肉瘤并發(fā)肺轉(zhuǎn)模型，對(duì)腫瘤生長(zhǎng)進(jìn)行活體熒光成像觀察，利用光學(xué)分子成像實(shí)現(xiàn)無(wú)創(chuàng)、實(shí)時(shí)和連續(xù)觀察腫瘤的生長(zhǎng)。二、初步研究人重組內(nèi)皮抑素（恩度）對(duì)人骨肉瘤143B細(xì)胞裸鼠原位腫瘤模型的作用，結(jié)合上述骨肉瘤模型瘤模型，觀察內(nèi)皮抑素及聯(lián)合順鉑，對(duì)人骨肉瘤細(xì)胞移植瘤裸鼠的作用。
　　 方法:一、利用含紅色熒光蛋白的病毒載體DsRed轉(zhuǎn)染人骨肉瘤細(xì)胞143B細(xì)胞系，行細(xì)胞培養(yǎng)并能使長(zhǎng)期穩(wěn)定表達(dá)的方法，將標(biāo)記的人骨

4、肉瘤143B細(xì)胞，接種植裸鼠脛骨近端建立原位腫瘤模型，并在不同時(shí)間對(duì)裸鼠活體成像，觀察腫瘤的生長(zhǎng)變化及肺轉(zhuǎn)移情況。二在利用建立的腫瘤模型研究?jī)?nèi)皮抑素對(duì)人骨肉瘤的抑制作用，并驗(yàn)證其對(duì)骨肉瘤生存期的作用。第一部分:用前述建模方法方法在15只裸鼠上建立標(biāo)記的裸鼠移植瘤模型，待80％裸鼠通過熒光觀察成瘤長(zhǎng)出后后分組，隨機(jī)分成三組，每組5只，為陰性對(duì)照組生理鹽水5只，實(shí)驗(yàn)組單獨(dú)內(nèi)皮抑素低劑量(0.75mg/kg)治療組，實(shí)驗(yàn)組單獨(dú)內(nèi)皮抑素低劑量(

5、1.5mg/kg)治療組組5只，給藥方式均為腹腔內(nèi)注射，每周2次光學(xué)活體成像儀下進(jìn)行活體成像，觀察熒光團(tuán)塊變化同時(shí)傳統(tǒng)方法測(cè)量腫瘤體積，給藥三周后比較各組抑瘤率。第二部分在20只裸鼠上建立標(biāo)記的裸鼠移植瘤模型，待80％裸鼠長(zhǎng)出后后分組，隨機(jī)分成四組，每組5只，為陰性對(duì)照組生理鹽水5只，實(shí)驗(yàn)組單獨(dú)內(nèi)皮抑素(0.75mg/kg)治療組，實(shí)驗(yàn)組順鉑(5mg/kg)治療組組5只，實(shí)驗(yàn)組順鉑聯(lián)合內(nèi)皮抑素低劑量治療組組5只，給藥方式均為腹腔內(nèi)注射，

6、每周2次光學(xué)活體成像儀下進(jìn)行活體成像，荷瘤鼠給藥3周后停止給藥，觀察動(dòng)物直至荷瘤鼠自然死亡，統(tǒng)計(jì)不同干預(yù)措施下的生存時(shí)間。
　　 結(jié)果:成功獲得了連續(xù)表達(dá)紅色熒光蛋白的143B細(xì)胞系，將該細(xì)胞系接種至裸鼠脛骨近端，成瘤率100％，通過熒光成像儀可以連續(xù)對(duì)腫瘤的生長(zhǎng)變化進(jìn)行觀察，并對(duì)藥物治療對(duì)瘤體的作用進(jìn)行觀察。應(yīng)用恩度(1.5mg/kg，qd×3w，腹腔注射)的治療組，在治療三周后，荷瘤鼠原發(fā)腫瘤的平均瘤重和生理鹽水組相比較無(wú)明

7、顯的減輕，且統(tǒng)計(jì)學(xué)分析上無(wú)顯著性差異(P＞0.05);應(yīng)用恩度(0.75mg/kg，qd×3w，腹腔注射)的治療組，在治療三周后，荷瘤鼠原發(fā)腫瘤的平均瘤重和生理鹽水組相比較有明顯的減輕，且統(tǒng)計(jì)學(xué)分析上有顯著性差異(P＜0.05);應(yīng)用恩度(0.75mg/kg，qd×3w，腹腔注射)的治療組、應(yīng)用恩度（1.5mg/kg，qd×3w，腹腔注射）的治療組，在治療三周后，荷瘤鼠原發(fā)腫瘤的平均腫瘤大小和生理鹽水組相比較無(wú)明顯的減輕，且統(tǒng)計(jì)學(xué)分析上

8、無(wú)顯著性差異(P＞0.05);應(yīng)用恩度(0.75mg/kg，qd×3w，腹腔注射)的治療組、應(yīng)用恩度(1.5mg/kg，qd×3w，腹腔注射)的治療組，在治療三周后各組之間的腫瘤轉(zhuǎn)移率沒有明顯的差異(P＞0.05);從荷瘤鼠的生存時(shí)間來(lái)看，恩度治療組的平均生存時(shí)間比對(duì)照組延長(zhǎng)30天左右，可以提示恩度可以改善荷瘤鼠的身體狀況，延長(zhǎng)生存時(shí)間;通過監(jiān)測(cè)整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程中荷瘤鼠的體重和身體狀況，可以提示生理鹽水組、各劑量的恩度治療組的藥物沒有明顯的

9、副作用和毒性;而應(yīng)用順鉑的治療組5在給藥一周內(nèi)全部死亡，說明5mg/kg劑量的順鉑對(duì)動(dòng)物有明顯的毒性作用。
　　 結(jié)論:通過該模型可以觀察原位骨肉瘤的不同生長(zhǎng)過程并且出現(xiàn)肺轉(zhuǎn)移，并且可以通過活體成像儀對(duì)其進(jìn)行連續(xù)觀察，因此可以成為研究骨肉瘤的生長(zhǎng)及肺轉(zhuǎn)移因素的促進(jìn)或限制因素的一種重要工具。該模型的建立方法可靠，簡(jiǎn)單，可重復(fù)。單用及聯(lián)合使用順鉑對(duì)143B骨肉瘤毒性作用較大，本次實(shí)驗(yàn)中順鉑作用無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，單用恩度各劑量治療對(duì)腫瘤的