穩(wěn)定表達(dá)乙型腦炎病毒NS2B-NS4B細(xì)胞系的構(gòu)建及其在篩選互作蛋白中的初步應(yīng)用.pdf

1、日本乙型腦炎病毒(Japanese Encephalitis Virus，JEV)屬于黃病毒科（Flaviviridae）黃病毒屬，是一種典型的嗜神經(jīng)病毒。該病毒豐要經(jīng)蚊蟲(chóng)傳播，并嚴(yán)重危害人、畜健康。人類發(fā)病后死亡率高，且治愈后往往留下神經(jīng)學(xué)后遺癥。在豬群中，該病毒主要引起妊娠母豬流產(chǎn)、產(chǎn)死胎或木乃伊胎，公豬發(fā)生睪丸炎，育肥豬持續(xù)高熱等，給養(yǎng)豬業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。
　　NS2B和NS4B蛋白是JEV的2個(gè)重要的非結(jié)構(gòu)蛋白，它們的

2、功能尚待解答。本研究旨在構(gòu)建能穩(wěn)定表達(dá)NS2B和NS4B蛋白的細(xì)胞系，并在此基礎(chǔ)上，通過(guò)串聯(lián)親和層析（Tandem Affinity Purification，TAP）與質(zhì)譜(Mass spectrometry analysis，MS)技術(shù)，篩選可能與它們相互作用的宿主蛋白，從而為深入闡明NS2B和NS4B的功能及其與宿主細(xì)胞相互作用機(jī)制的研究奠定基礎(chǔ)。
　　具體研究?jī)?nèi)容如下:
　　1.構(gòu)建細(xì)胞系
　　利用RT-PCR

3、方法擴(kuò)增JEV NS2B和NS4B基因，并將之克隆至帶嘌呤霉素(Puromycin)抗性基因的載體Psin-EF2-MCS-Pur中。然后利用慢病毒載體包裝系統(tǒng)，與psPAX2和pMD2.G共同轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，收獲的慢病毒粒子轉(zhuǎn)導(dǎo)正常293T細(xì)胞，通過(guò)嘌呤霉素篩選純化細(xì)胞系Cellline-NS2B和Cellline-NS4B。同時(shí)，用空載體包裝病毒，相同方法獲得對(duì)照組細(xì)胞系Cellline-vector。
　　2.細(xì)胞系的驗(yàn)證

4、
　　對(duì)已經(jīng)得到的慢病毒細(xì)胞系，采用三種方式進(jìn)行驗(yàn)證:嘌呤霉素抗性實(shí)驗(yàn);免疫熒光染色;Western blot驗(yàn)證。三種方法都證明了細(xì)胞系中目的蛋白能穩(wěn)定、高效表達(dá)。
　　3.篩選互作蛋白
　　利用建立的細(xì)胞系，進(jìn)行串聯(lián)親和層析實(shí)驗(yàn)，洗脫后的產(chǎn)物進(jìn)行SDS-PAGE膠分離并進(jìn)行銀染處理，分析實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組產(chǎn)物條帶的區(qū)別，并結(jié)合質(zhì)譜分析的方法找出在293T細(xì)胞中與JEV NS2B和NS4B蛋白相互作用的宿主蛋白質(zhì)。最終我