毒害艾美球蟲cDNA文庫的構(gòu)建和基因篩選.pdf

1、雞球蟲屬于頂復(fù)器門(Apicomplexa)、孢子蟲綱(Sporozoa)、球蟲亞綱(Coccidiasina)、真球蟲目(Eucoccidiorida)的寄生原蟲，頂復(fù)器門包含了一些重要的獸醫(yī)寄生蟲和醫(yī)學(xué)寄生蟲(如艾美球蟲、瘧原蟲、巴貝斯蟲、弓形蟲、隱孢子蟲、住肉孢子蟲等)。在這些寄生蟲中，寄生在腸道上皮細(xì)胞的艾美球蟲(Eimeria)主要破壞家禽腸道上皮細(xì)胞，從而威脅家禽健康和導(dǎo)致全球范圍內(nèi)養(yǎng)禽業(yè)的嚴(yán)重經(jīng)濟(jì)損失。長(zhǎng)期以來球蟲病的防治

2、以藥物為主，但是由于球蟲抗藥性的普遍存在，新藥研制費(fèi)用昂貴，加之藥物或抗生素在家禽產(chǎn)品中的殘留問題越來越受到消費(fèi)者的關(guān)注，迫使人們尋求防治的新途徑。在眾多控制球蟲病的方法中，基因疫苗防治前景誘人，而要研制高效的基因工程疫苗關(guān)鍵在于尋找最佳的蟲體抗原基因。本研究以毒害艾美球蟲(E.necatrix)為研究對(duì)象，從其普通生物學(xué)和分子生物兩方面鑒定其為純種，后用其孢子化卵囊構(gòu)建了cDNA表達(dá)文庫，從中篩選免疫抗原基因，獲得了以下結(jié)果。

3、 1.按照傳統(tǒng)生物學(xué)鑒定方法選取潛在期、寄生部位、最短孢子化時(shí)間、卵囊形狀、卵囊大小及孢子囊大小等指標(biāo)對(duì)毒害艾美球蟲(廣東株)進(jìn)行了鑒定。獲取了毒害艾美球蟲的一系列生物學(xué)特性，從而初步驗(yàn)證了該單卵囊分離株是純種。為了進(jìn)一步驗(yàn)證該蟲株是純種，分別利用柔嫩艾美球蟲(E.tenella)、巨型艾美球蟲(E.maxima)和堆形艾美球蟲(E.acervulina)的特異性引物，對(duì)純化的卵囊DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，結(jié)果擴(kuò)增不出來這些引物相應(yīng)的目的片

4、段，從分子生物學(xué)角度驗(yàn)證了該蟲株是純種。 2.用純化的毒害艾美球蟲孢子化卵囊口服接種感染雛雞，制備雞抗毒害艾美球蟲陽性血清；用純化的毒害艾美球蟲孢子化卵囊超聲裂解后的可溶性蛋白作為抗原加佐劑乳化后免疫家兔，制備兔抗毒害艾美球蟲陽性血清。經(jīng)ELISA檢測(cè)，結(jié)果表明僅兔抗毒害艾美球蟲陽性血清可用于毒害艾美球蟲cDNA表達(dá)文庫的免疫學(xué)篩選。 3.以毒害艾美球蟲孢子化卵囊為材料，利用SMARTTMcDNA文庫構(gòu)建試劑盒成功構(gòu)建了

5、毒害艾美球蟲孢子化卵囊cDNA表達(dá)文庫。原始文庫滴度為4.72x106pfu/mL，擴(kuò)增后的文庫滴度為2.62x1010pfu/mL，文庫重組率為97.5％，插入片段集中在500～1100bp之間。 4.利用兔抗毒害艾美球蟲陽性血清對(duì)毒害艾美球蟲孢子化卵囊cDNA表達(dá)文庫進(jìn)行免疫學(xué)篩選，共獲得3個(gè)陽性克隆。經(jīng)鑒定，3個(gè)陽性克隆基因序列一致，基因的閱讀框?yàn)?44bp，共編碼133個(gè)氨基酸。登錄GenBank進(jìn)行同源性比較，結(jié)果該基