椎間盤退變病理機(jī)制的研究.pdf

1、本研究分為五部分： 第一部分：內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和凋亡參與椎間盤退變 目的：探討內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和凋亡是否參與了動(dòng)靜力失衡所致大鼠椎間盤退變過(guò)程。 方法：制作大鼠腰椎動(dòng)靜力失衡模型，X線和HE染色檢測(cè)腰椎椎間盤退變程度，TUNEL染色原位檢測(cè)細(xì)胞凋亡，免疫組化染色檢測(cè)GRP78、GADD153和Caspase12的表達(dá)。 結(jié)果：隨著造模時(shí)間延長(zhǎng)，X線和HE染色顯示大鼠腰椎椎間盤退變程度逐漸加重，TUNEL染色顯示細(xì)胞凋

2、亡率上升，免疫組化染色顯示GRP78、GADD153和Caspase12的表達(dá)也隨之增強(qiáng)。 結(jié)論：腰椎動(dòng)靜力失衡成功誘導(dǎo)了大鼠腰椎椎間盤退變，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和凋亡參與了椎間盤退變過(guò)程。 第二部分：內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和線粒體共同參與大鼠纖維環(huán)細(xì)胞凋亡 目的：探討內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和線粒體是否共同參與了大鼠纖維環(huán)細(xì)胞的凋亡過(guò)程。 方法：以硝普鈉刺激單層培養(yǎng)的大鼠纖維環(huán)細(xì)胞，相差顯微鏡下動(dòng)態(tài)觀察細(xì)胞形態(tài)變化，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率，RT

3、-PCR、免疫共定位和WesternBlot檢測(cè)GRP78、GADD153和Caspase12的表達(dá)，檢測(cè)胞漿內(nèi)細(xì)胞色素C含量和線粒體膜電位的變化，并檢測(cè)NS3694和Z-ATAD-FMK對(duì)細(xì)胞凋亡率和Caspase9活性的影響。 結(jié)果：形態(tài)學(xué)觀察證實(shí)大鼠纖維環(huán)細(xì)胞以凋亡的方式死亡；流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)顯示在硝普鈉刺激后其凋亡率以時(shí)間依賴方式上升；GRP78、GADD153和Caspase12的表達(dá)均增高，GRP78表達(dá)的增高要早于G

4、ADD153和Caspase12：胞漿內(nèi)細(xì)胞色素C含量增高、線粒體膜電位下降，線粒體膜電位的下降要早于細(xì)胞凋亡率的增高；NS3694和Z-ATAD-FMK顯著降低硝普鈉刺激后大鼠纖維環(huán)細(xì)胞的凋亡率和Caspase9活性。 結(jié)論：內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和線粒體共同參與了大鼠纖維環(huán)細(xì)胞的凋亡過(guò)程。 第三部分：IL-1β增強(qiáng)血清剝奪誘導(dǎo)大鼠纖維環(huán)細(xì)胞凋亡的效應(yīng) 目的：觀察IL-1B對(duì)伴或不伴血清剝奪情況下大鼠纖維環(huán)細(xì)胞凋亡的影響。

5、 方法：以0、10、20或50ng/ml的重組大鼠IL-1β刺激培養(yǎng)于含有10％血清或不含血清的培養(yǎng)液中的大鼠纖維環(huán)細(xì)胞12、24或48小時(shí)，Hoechst33258染色觀察細(xì)胞核形態(tài)變化，相差顯微鏡觀察細(xì)胞膜形態(tài)變化，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)凋亡率，并檢測(cè)Caspase3的活性。 結(jié)果：大鼠纖維環(huán)細(xì)胞在含有10％血清的培養(yǎng)液中培養(yǎng)時(shí)，IL-1β對(duì)細(xì)胞形態(tài)、細(xì)胞凋亡率和Caspase3的活性均無(wú)顯著影響；血清剝奪引起細(xì)胞凋亡率和Cas

6、pase3活性輕微的但有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的增高，同時(shí)細(xì)胞核致密濃染或碎裂、胞膜發(fā)泡的細(xì)胞數(shù)量增多：IL-1β以劑量依賴方式增加血清剝奪對(duì)大鼠纖維環(huán)細(xì)胞的影響。 結(jié)論：IL-1β作為單一刺激因素并不能誘導(dǎo)纖維環(huán)細(xì)胞凋亡，它僅能增加纖維環(huán)細(xì)胞對(duì)血清剝奪所致的凋亡的敏感性。 第四部分：蛋白多糖酶-2在突出椎間盤內(nèi)的表達(dá)及一氧化氮介導(dǎo)IL-1β誘導(dǎo)的大鼠髓核細(xì)胞表達(dá)蛋白多糖酶-2 目的：檢測(cè)蛋白多糖酶-2在人突出椎間盤內(nèi)的表達(dá)

7、，并探討一氧化氮是否介導(dǎo)了IL-1β誘導(dǎo)的大鼠髓核細(xì)胞表達(dá)蛋白多糖酶-2。 方法：免疫組化染色檢測(cè)蛋白多糖酶-2陽(yáng)性細(xì)胞在人突出椎間盤內(nèi)的區(qū)域分布及其與患者臨床資料的關(guān)系；用不同濃度的重組大鼠IL-1β刺激在藻酸鈉小珠內(nèi)三維培養(yǎng)的大鼠髓核細(xì)胞，RT-PCR檢測(cè)iNOS和蛋白多糖酶-2的mRNA表達(dá)，Griess反應(yīng)檢測(cè)培養(yǎng)液內(nèi)一氧化氮的含量變化，阿爾新藍(lán)染色檢測(cè)蛋白多糖量的變化，并觀察氨基胍是否可對(duì)抗IL-1β對(duì)髓核細(xì)胞的影響。

8、 結(jié)果：蛋白多糖酶-2的表達(dá)在細(xì)胞簇中高于在單個(gè)或成對(duì)細(xì)胞中，在非包含型突出椎間盤內(nèi)高于在包含型突出椎間盤內(nèi)，并與患者的年齡呈正相關(guān)；IL-1β以劑量依賴方式增加髓核細(xì)胞表達(dá)iNOS和蛋白多糖酶-2，并增加一氧化氮的合成，同時(shí)藻酸鈉小珠內(nèi)的蛋白多糖含量下降；氨基胍可顯著抑制IL-1β對(duì)髓核細(xì)胞的影響。 結(jié)論：蛋白多糖酶-2可能在椎間盤退變過(guò)程中發(fā)揮了一定作用，IL-1β通過(guò)誘導(dǎo)大鼠髓核細(xì)胞合成一氧化氮而增加蛋白多糖酶-2

9、的表達(dá)。 第五部分：瘦素及其功能性受體在突出椎間盤內(nèi)的表達(dá)和瘦素對(duì)大鼠髓核細(xì)胞增殖的影響 目的：檢測(cè)瘦素及其功能性受體在人突出椎間盤內(nèi)的表達(dá)，并探討瘦素對(duì)大鼠髓核細(xì)胞增殖的影響。 方法：免疫組化染色檢測(cè)瘦素及其功能性受體陽(yáng)性染色細(xì)胞在人突出椎間盤內(nèi)的區(qū)域分布及其與患者臨床資料的關(guān)系；用不同濃度的重組大鼠瘦素刺激單層培養(yǎng)的大鼠髓核細(xì)胞，MTT檢測(cè)細(xì)胞生長(zhǎng)，免疫細(xì)胞化學(xué)檢測(cè)增殖細(xì)胞核抗原(PCNA)的表達(dá)。