煙酰胺治療兔椎間盤退變的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、一.煙酰胺對(duì)體外培養(yǎng)兔椎間盤基質(zhì)的保護(hù)作用 目的:觀察煙酰胺對(duì)椎間盤蛋白聚糖及Ⅱ型膠原的保護(hù)作用，并探討其機(jī)制。 方法:構(gòu)建兔椎間盤組織凝膠培養(yǎng)模型，以白介素-1β(IL-1β)誘發(fā)其退變。將其分為1～6組：第1組為正常對(duì)照，2～6組分別加入0.5mg/mlNia；10ng/mlIL-1β；10ng/mlIL-1β及0.5mgNia，10ng/mlIL-1β及0.25mgNia；10ng/mlIL-1β及0.05mgNi

2、a。培養(yǎng)至1周及2周時(shí)對(duì)各組標(biāo)本藏紅O-快綠染色，葡萄糖醛酸含量測(cè)定，以及aggrecan核心蛋白，培養(yǎng)至2周時(shí)行椎間盤Ⅱ型膠原RT-PCR及免疫組化檢測(cè)，培養(yǎng)1周時(shí)行iNOS及TGF-β1免疫組化檢測(cè)。 結(jié)論：體外條件下，煙酰胺可提高椎間盤聚集蛋白聚糖及Ⅱ型膠原含量，對(duì)抗IL-1β誘發(fā)的蛋白聚糖和Ⅱ型膠原含量下降。這種保護(hù)作用與其抑制iNOS的表達(dá)和保護(hù)TGF-β1的表達(dá)有關(guān)。煙酰胺具備用于椎間盤退變臨床治療的潛力。

3、二.煙酰胺對(duì)體外培養(yǎng)兔椎間盤組織凋亡及能量代謝相關(guān)基因的影響 目的:觀察煙酰胺(Nia)對(duì)白介素-1β(IL-1β)誘導(dǎo)的體外培養(yǎng)的椎間盤組織內(nèi)細(xì)胞凋亡的抑制作用及能量代謝相關(guān)基因：HIF-1α(缺氧誘導(dǎo)因子-1α)、GLUT-1(葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白-1)和VEGF(血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子)表達(dá)的影響。 方法:構(gòu)建兔椎間盤組織凝膠培養(yǎng)模型，將其分為1～4組：第1組為正常對(duì)照，2～4組分別加入0.5mg/mlNia；10ng/mlI

4、L-1β；10ng/mlIL-1β及0.5mgNia。培養(yǎng)一周后對(duì)各組標(biāo)本行TUNEL、FAS、Caspase-3、Bcl-2、HIF-1α，GLUT-1及VEGF免疫組化染色。 結(jié)論:煙酰胺可以抑制IL-1β誘導(dǎo)的椎間盤細(xì)胞凋亡。煙酰胺對(duì)椎問盤組織的能量代謝有促進(jìn)作用，可以改善IL-1β導(dǎo)致的能量代謝障礙。 三.煙酰胺對(duì)兔髓核細(xì)胞增殖及凋亡的調(diào)節(jié)作用 目的:考察煙酰胺(Nia)對(duì)髓核細(xì)胞增殖及凋亡的調(diào)控作用及其

5、機(jī)制。 方法:體外培養(yǎng)兔髓核細(xì)胞，將其分為1～6組：第1組為正常對(duì)照組，不加入藥物。2～6組分別加入0.5mg/ml煙酰胺，10ng/mlIL-1β，10ng/mlIL-1β及非特異性Caspase抑制劑Z-VAD-FMK，10ng/mlIL-1β及0.05mg/ml煙酰胺，10ng/mlIL-1β及0.5mg/ml煙酰胺。藥物處理3天后對(duì)各組細(xì)胞行AnnexinV-PI染色、Caspase-3、Caspase-8、Caspas

6、e-9功能的流式細(xì)胞儀檢測(cè)，熒光顯微鏡照相及MTT法檢測(cè)。 結(jié)論:煙酰胺可以促進(jìn)髓核細(xì)胞的增殖和抑制IL-1β誘導(dǎo)的髓核細(xì)胞凋亡，對(duì)于凋亡的抑制作用主要通過抑制Caspase-9相關(guān)的線粒體凋亡途徑實(shí)現(xiàn)的。 四.可控壓力致兔腰椎間盤退變模型的構(gòu)建及其對(duì)纖維環(huán)能量代謝相關(guān)基因的影響 目的:構(gòu)建“可控壓力致兔腰椎問盤退變模型”，并考查該模型能量代謝相關(guān)基因：HIF-1α(缺氧誘導(dǎo)因子-1α)、GLUT-1(葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)

7、蛋白-1)和VEGF(血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子)的表達(dá)情況并探討其意義。 方法:采用可控壓力致兔腰椎問盤退變模型構(gòu)建輕度兔椎問盤退變模型，Thompson分級(jí)及HE化染色觀察退變程度。以10kg軸向壓力獲得加壓24h組、72h組、加壓24h后恢復(fù)48h組(恢復(fù)組)及正常對(duì)照組兔椎間盤標(biāo)本，分離其纖維環(huán)組織，RT-PCR檢測(cè)HIF-1α、GLUT-1基因的表達(dá)，WesternBlot及免疫組化檢測(cè)VEGF的含量及分布。 結(jié)論:可控

8、壓力致椎間盤退變模型可以有效地誘發(fā)壓力導(dǎo)致的椎間盤退變。能量代謝相關(guān)基因表達(dá)的變化在壓力致椎間盤組織損傷及損傷后修復(fù)的過程中扮演者重要角色。因此，將具有細(xì)胞能量代謝促進(jìn)作用的煙酰胺應(yīng)用于椎間盤退變的治療和預(yù)防具有可靠的理論基礎(chǔ)。 五.煙酰胺治療可控壓力致兔腰椎間盤退變模型的實(shí)驗(yàn)研究 目的:考查煙酰胺對(duì)壓力導(dǎo)致的兔椎問盤退變的治療作用。 方法:構(gòu)建可控壓力致兔椎間盤退變模型。將24只日本大白兔隨機(jī)分入1～6組：第1

9、組2只，為假手術(shù)對(duì)照組；第2組2只，給與約50mg/kg煙酰胺口服1周；第3組5只，以10kg壓力加壓1周；第4組5只，以10kg壓力加壓1周，白行恢復(fù)1周，第5組5只，加壓1周，給予約50mg/kg煙酰胺口服1周，第6組5只，給與約50mg/kg煙酰胺口服2周，這期間先加壓1周，然后恢復(fù)1周。對(duì)各組標(biāo)本進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察、HE染色、藏紅O-快綠染色及Ⅱ型膠原免疫組化染色。 結(jié)論:煙酰胺有助于減輕壓力對(duì)椎問盤的損傷，能夠促進(jìn)壓力損傷