NF-κB信號通路在炎癥狀態(tài)下人牙周膜干細胞成骨分化中的調(diào)控作用.pdf

1、牙周病是造成成年人缺牙的首要原因,發(fā)病率高達90％。其發(fā)病機制是由于細菌聚集于牙表面或侵入牙周組織,通過直接侵襲及引發(fā)機體慢性炎癥反應,引起牙周軟組織連接的破壞及牙槽骨的吸收,造成牙支持結(jié)構(gòu)的喪失,最終導致牙松動脫落。目前尚沒有有效根治牙周病的手段和方法。
　　正常情況下,牙周組織具備良好的再生能力,牙槽骨與牙周膜始終處于動態(tài)改建過程中,維持著牙周支持結(jié)構(gòu)的完整性。牙周膜中有一群多潛能成體干細胞,表達間充質(zhì)干細胞的表面標志物,具備

2、自我更新及多向分化能力,體外誘導能夠形成骨、軟骨、神經(jīng)、脂肪、血管等多種組織,并能在體內(nèi)移植后形成牙骨質(zhì)-牙周膜-牙槽骨樣結(jié)構(gòu)物,被認為在牙周改建、再生、修復過程中發(fā)揮了重要作用。已有研究發(fā)現(xiàn)牙周局部炎癥微環(huán)境可以通過抑制 PDLSCs的再生能力導致牙周組織的破壞,但其具體機制尚不清楚。
　　NF-κB是免疫轉(zhuǎn)錄過程中的關(guān)鍵核轉(zhuǎn)錄因子。各種急性及慢性炎癥均能導致NF-κB信號通路活化,并通過轉(zhuǎn)錄激活下游免疫相關(guān)基因而發(fā)揮重要作用。

3、同時,NF-κB信號通路通過調(diào)控 RANKL/RANK表達、調(diào)節(jié)成骨分化信號通路及骨基質(zhì)形成,而對骨發(fā)育和骨改建過程發(fā)揮關(guān)鍵調(diào)控作用。但以往研究大多關(guān)注于炎癥因子活化NF-κB信號通路對破骨細胞形成及活化的作用,對于其是否參與了牙周病慢性炎癥的發(fā)生發(fā)展過程,是否導致了牙周病骨形成缺陷,是否對 PDLSCs的成骨分化具有抑制作用,及其具體的信號調(diào)控途徑及機制尚不明確。因此,本實驗利用從健康人群和牙周病患者牙周組織中分離純化的牙周膜干細胞,

4、比較NF-κB信號通路在不同來源干細胞中的表達差異,研究其在炎癥條件下對 PDLSCs成骨分化的作用機制,從而加深對牙周病發(fā)病機制的了解,并為尋找特異性的治療靶點、探索基于干細胞的再生手段提供新的思路。
　　研究目的:
　　1)探討牙周組織局部慢性炎癥微環(huán)境對人牙周膜干細胞(human periodontal periodontal ligament stem cells,hPDLSCs)生物學特性的影響。
　　2)探

5、討炎癥微環(huán)境對hPDLSCs內(nèi)NF-κB信號通路的影響,及NF-κB信號通路對人牙周膜干細胞成骨分化的調(diào)控作用。
　　3)探討炎癥微環(huán)境是否通過NF-κB通路抑制了hPDLSCs的成骨分化;調(diào)控 NF-κB通路中關(guān)鍵分子能否逆轉(zhuǎn)炎癥微環(huán)境對于牙周膜干細胞成骨分化的抑制。
　　研究方法:
　　1)利用組織消化、有限稀釋法獲取正常和慢性牙周炎癥來源的hPDLSCs,免疫細胞化學技術(shù)和流式細胞術(shù)檢測兩種細胞表面間充質(zhì)干細胞標

6、志分子的表達,MTT、克隆形成實驗及細胞周期檢測比較兩種干細胞的增殖能力,成骨和成脂分化誘導檢測兩種干細胞的多向分化能力。
　　2)利用Western Blot檢測p65、IκBα和p-IκBα在不同來源牙周膜干細胞及其成骨分化過程中的表達差異。通過利用BAY11-7082抑制NF-κB通路后茜素紅染色、成骨關(guān)鍵基因和蛋白的檢測比較 NF-κB信號通路在hPDLSCs成骨過程中的調(diào)控作用。
　　3)利用TNF-α(10ng/

7、mL)模擬牙周炎癥微環(huán)境,激活NF-κB信號通路,進行獲得性功能驗證;利用BAY11-7082抑制NF-κB信號通路,進行缺失性功能研究。
　　實驗結(jié)果:
　　1)分離培養(yǎng)的兩種牙周膜干細胞均表現(xiàn)為間充質(zhì)細胞特性。體外有限稀釋法單細胞培養(yǎng)均出現(xiàn)細胞克隆,表現(xiàn)出自我更新能力;炎癥組的克隆形成率高于正常組;MTT和細胞周期均顯示炎癥來源干細胞的增值能力明顯高于對照組;成骨、成脂誘導后實驗結(jié)果表明炎癥來源的牙周膜干細胞的分化能力不

8、如正常牙周膜干細胞。
　　2)炎癥組織來源的牙周膜干細胞成骨分化過程中,IκBα磷酸化上調(diào)表達較正常組織來源細胞明顯,核內(nèi)p65表達也增高。而在加入BAY11-7082后,能部分恢復炎癥組織來源的牙周膜干細胞的成骨能力。
　　3)炎癥因子 TNF-α刺激正常組織來源的牙周膜干細胞后,NF-κB信號通路明顯激活,成骨相關(guān)基因和蛋白表達明顯下調(diào),說明hPDLSCs的成骨能力收到了抑制。在TNF-α刺激的同時加入BAY11-708

9、2后,成骨相關(guān)基因和蛋白的表達上調(diào),說明抑制 NF-κB通路能部分恢復 TNF-α所致的牙周膜干細胞的成骨分化能力的降低。
　　結(jié)論:
　　1.牙周慢性炎癥環(huán)境影響了牙周膜內(nèi)干細胞的生物學特性。
　　2.炎癥牙周膜干細胞中 NF-κB信號通路的活化抑制了 P-PDLSCs的成骨分化能力,BAY11-7082阻斷NF-κB信號通路后,能部分恢復其成骨能力。
　　3.炎癥因子TNF-α能明顯激活NF-κB信號通路,并