內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激介導(dǎo)的PERK-eIF2α-ATF4信號通路在牽張力作用下牙周膜干細胞成骨向分化中的作用研究.pdf

1、目的：
　　本研究通過人牙周膜干細胞的原代培養(yǎng)，構(gòu)建牙周膜干細胞體外培養(yǎng)-力學(xué)刺激模型，并檢測不同加力時間點后內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)因子和成骨相關(guān)基因的表達的水平變化，并在此基礎(chǔ)上，采用慢病毒質(zhì)粒包裝構(gòu)建過表達、沉默表達PERK的穩(wěn)定細胞系，對正常牙周膜干細胞和病毒轉(zhuǎn)染的牙周膜干細胞實施應(yīng)力刺激，研究ERS介導(dǎo)的PERK-eIF2α-ATF4信號通路在牽張力作用下牙周膜干細胞的成骨向分化過程中的作用。本課題試圖闡明力學(xué)因素下PERK-eI

2、F2α-ATF4信號通路在調(diào)控人牙周膜干細胞成骨分化過程中的作用，為臨床矯治提供理論依據(jù)，為進一步研究正畸牙槽骨改建的分子生物學(xué)機制提供科學(xué)依據(jù)，提高矯治效果提供新的思路和方向。
　　方法：
　　1.人牙周膜干細胞分離培養(yǎng)及鑒定
　　采用傳統(tǒng)的組織塊法分離培養(yǎng)人牙周膜干細胞，從而獲得原代人牙周膜干細胞。傳代后對細胞進行形態(tài)學(xué)觀察，并利用血細胞計數(shù)板對細胞進行計數(shù)，繪制生長曲線。通過免疫細胞化學(xué)染色和流式細胞術(shù)對培養(yǎng)的人

3、牙周膜干細胞進行鑒定。
　　2.觀察牽張力加載下人牙周膜干細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)因子及成骨相關(guān)因子的表達變化
　　選擇第4-6代生長旺盛，性質(zhì)穩(wěn)定的人牙周膜干細胞進行實驗。將細胞以2.5×105/孔的密度接種于BioFlex彈性膜六孔培養(yǎng)板上，培養(yǎng)24小時后換用含2％胎牛血清的條件培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)24小時后將培養(yǎng)板置于多通道細胞牽張應(yīng)力加載系統(tǒng)中，對細胞施加振幅10％，頻率0.5HZ的周期性牽張力，加力作用時間為1h，3h，6h

4、，12h，18h，24h。在相應(yīng)的時間點，提取總RNA和核蛋白，采用熒光定量PCR和Western Blot測定內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)因子(Bip，Xbp1，PERK，eIF2α，p-eIF2α)及成骨相關(guān)基因ATF4，OCN，BSP的表達變化。
　　3.分析PERK-eIF2α-ATF4信號通路在牽張力作用下牙周膜干細胞成骨分化中的作用
　　利用上海吉凱公司設(shè)計合成并進行慢病毒包裝獲得過表達PERK基因的慢病毒，干擾PERK基因的

5、慢病毒以及陰性對照的慢病毒。對人牙周膜干細胞進行病毒轉(zhuǎn)染，構(gòu)建過表達和沉默PERK的牙周膜干細胞模型，隨后進行靶細胞感染預(yù)實驗以及病毒感染復(fù)數(shù)(MOI)值得摸索，利用最佳MOI值對靶細胞進行感染，通過熒光定量PCR以及Western Blot證實穩(wěn)定轉(zhuǎn)染過表達和干擾PERK的牙周膜干細胞內(nèi)PERK的mRNA和蛋白水平。采用茜素紅染色來評價基質(zhì)礦化的程度，同時對感染病毒的細胞也進行了牽張力的加載，拉伸強度10％，頻率0.5HZ，加力12h

6、。采用熒光定量PCR和Western Blot檢測p-eIF2α和成骨相關(guān)基因-ATF4，OCN和BSP的表達水平來進一步分析PERK-eIF2α-ATF4信號通路在牙周膜干細胞成骨分化中的作用。
　　結(jié)果：
　　1.采用組織塊法成功分離培養(yǎng)了原代的人牙周膜干細胞，傳代后牙周膜干細胞生長旺盛，狀態(tài)良好，形態(tài)上具備成纖維細胞的特性，約傳代后2-3天開始指數(shù)增長，8天達到峰值。人牙周膜干細胞通過染色發(fā)現(xiàn)波形絲蛋白陽性，角蛋白染色

7、陰性證明其為來源于間充質(zhì)的細胞群，并通過成骨誘導(dǎo)和成脂誘導(dǎo)表明人牙周膜干細胞具有多向分化能力。
　　2.人牙周膜干細胞在牽張力作用下形態(tài)發(fā)生一些變化，細胞明顯被拉伸，在培養(yǎng)板上逐漸呈方向性生長。細胞加力后內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)因子(Bip，Xbp1，PERK，eIF2α，p-eIF2α)及成骨相關(guān)基因(ATF4，OCN，BSP)的表達均發(fā)生了一些變化。Bip在加力后6h之內(nèi)變化不明顯，12h-24h后表達量逐漸增加;Xbp1的變化略有一些

8、波動，在加力3h和6h后表達略有下降，但12h后表達又開始上升。PERK表達量在加力后逐漸增加，加力3h和6h時表達達一個峰值，隨后隨時間延長逐漸恢復(fù)到一個穩(wěn)定的水平;p-eIF2α的表達在加力早期升高不明顯，隨加力時間增加而表達量升高，6h達峰值，而eIF2α基本沒變化。
　　另一方面，成骨相關(guān)基因-ATF4，骨鈣素(OCN)和骨涎蛋白(BSP)的表達水平基本上隨加力時間延長而升高。ATF4在加力早期1h后就急劇升高并達到峰值，

9、3h和6h時有所下降，后隨加力時間逐漸升高;OCN和BSP變化比較有規(guī)律，隨加力時間延長而表達量逐漸增加。結(jié)果證實了周期性張應(yīng)力可以促使內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)因子的表達以及牙周膜干細胞相關(guān)成骨基因的表達。
　　3.采用慢病毒對細胞進行轉(zhuǎn)染處理，熒光顯微鏡下可見在轉(zhuǎn)染后72h后病毒轉(zhuǎn)染效率最高。熒光定量PCR以及Western Blot證實穩(wěn)定轉(zhuǎn)染牙周膜干細胞在過表達PERK后PERK mRNA和蛋白水平都得到顯著的提高，而在PERK干擾后

10、PERKR的mRNA和蛋白水平顯著下降，并且單獨轉(zhuǎn)染陰性載體的牙周膜干細胞與正常牙周膜干細胞無明顯差異，慢病毒轉(zhuǎn)染成功。茜素紅染色實驗發(fā)現(xiàn)了PERK過表達的牙周膜干細胞體外培養(yǎng)3周后可以觀察到鈣結(jié)節(jié)，說明PERK的過表達促進了牙周膜干細胞的成骨分化;而PERK干擾的牙周膜干細胞體外培養(yǎng)3周后幾乎看不到鈣結(jié)節(jié)，說明PERK干擾抑制了牙周膜干細胞的成骨分化。
　　通過熒光定量PCR和Western Blot對牙周膜干細胞內(nèi)相關(guān)成骨基因

11、的水平進行測定，證實了PERK過表達可以有效促進p-eIF2α，ATF4，OCN和BSP的表達，牽張力刺激增加這一效應(yīng)，而PERK抑制減少了p-eIF2α，ATF4，OCN和BSP的表達，在牽張力刺激下，對p-eIF2α，ATF4，OCN和BSP的表達有所升高但不如PERK過表達組和PERK過表達同時加力組。
　　結(jié)論：
　　1.牽張力刺激促進內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)因子(Bip，Xbp1，PERK，p-eIF2α)及成骨相關(guān)基因(A

12、TF4，OCN，BSP)的表達變化，牽張力刺激可以在一定程度上誘發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的發(fā)生，從而進一步激活PERK-eIF2α-ATF4信號通路。
　　2.PERK過表達可以促進鈣離子的沉積和基質(zhì)礦化程度，進而促進牙周膜干細胞成骨分化;而PERK干擾則減少鈣離子的沉積和基質(zhì)礦化程度，抑制牙周膜干細胞成骨分化。
　　3.內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激介導(dǎo)的PERK-eIF2α-ATF4信號通路參與了牽張力作用下牙周膜干細胞成骨分化的過程。PERK過表達可

13、以有效促進p-eIF2α，ATF4，OCN和BSP的表達，牽張力刺激增加這一效應(yīng)，牽張力刺激和PERK過表達對牙周膜干細胞成骨基因表達有協(xié)同作用;而PERK抑制減少了p-eIF2α，ATF4，OCN和BSP的表達。
　　意義和創(chuàng)新點：
　　本課題首次研究了由內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激所介導(dǎo)的PERK-eIF2α-ATF4信號通路在牽張力作用下牙周膜干細胞成骨分化過程中的作用，提出了周期性牽張力作為一種應(yīng)激刺激可以激活內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng);并建立了