血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子（VEGF）基因轉(zhuǎn)染骨髓基質(zhì)干細(xì)胞（BMSCs）促進(jìn)骨缺損修復(fù)的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、本文分四部分論述了血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子（VEGF）基因轉(zhuǎn)染骨髓基質(zhì)干細(xì)胞（BMSCs）促進(jìn)骨缺損修復(fù)的實(shí)驗(yàn)研究?！　∫弧⒀軆?nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子(VEGF)基因轉(zhuǎn)染骨髓基質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)及其表達(dá)的檢測(cè)?！　∧康模簽榱颂接懷軆?nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子(VEGF)基因轉(zhuǎn)染骨髓基質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)的表達(dá)?！　》椒ǎ后w外分離、培養(yǎng)大鼠骨髓基質(zhì)干細(xì)胞，傳代培養(yǎng)后以lulPcDNA3．1．hVEGFl65：3ul陽(yáng)離子脂質(zhì)體Lipofectam

2、ine的比例轉(zhuǎn)染，通過(guò)RT-PCR、免疫組化S-P法檢測(cè)轉(zhuǎn)染細(xì)胞外源性VEGFl65基因瞬時(shí)表達(dá)與穩(wěn)定表達(dá)，采用ELISA進(jìn)行其VEGF蛋白表達(dá)量的檢測(cè)，并觀察轉(zhuǎn)染后細(xì)胞生長(zhǎng)增殖情況，與空載體轉(zhuǎn)染組和未轉(zhuǎn)染組相對(duì)照?！　〗Y(jié)果：基因轉(zhuǎn)染后細(xì)胞生長(zhǎng)增殖與對(duì)照組相仿，基因轉(zhuǎn)染后48h和篩選培養(yǎng)4周后，RT-PCR和免疫組化都能檢測(cè)到VEGF基因的轉(zhuǎn)錄及表達(dá)，而空載體轉(zhuǎn)染組及未轉(zhuǎn)染組未見其轉(zhuǎn)錄及表達(dá)。ELISA定量測(cè)定顯示轉(zhuǎn)染細(xì)胞VEGF表達(dá)

3、在l周內(nèi)逐漸增高，1周后則逐漸下降?！　〗Y(jié)論：　　1、通過(guò)脂質(zhì)體能成功的將hVEGFl 65基因轉(zhuǎn)入BMSCs并轉(zhuǎn)錄及表達(dá)VEGF蛋白，其蛋白表達(dá)量在1周時(shí)達(dá)最高，然后其表達(dá)分泌量逐漸下降。　　2、基因轉(zhuǎn)染后BMSCs經(jīng)G41 8篩選培養(yǎng)后可獲得穩(wěn)定表達(dá)?！　《?、hVEGF165基因轉(zhuǎn)染對(duì)BMSCs生物學(xué)特性的影響及其分泌蛋白功能的檢測(cè)?！　∧康模河^察hVEGFl65基因轉(zhuǎn)染后BMSCs分泌的VEGF蛋白是否有生物學(xué)效應(yīng)及其對(duì)

4、BMSCs成骨表型的影響?！　》椒ǎ后w外分離、培養(yǎng)大鼠腎微血管內(nèi)皮細(xì)胞，并通過(guò)免疫組化方法對(duì)其進(jìn)行鑒定。采用MTT法觀察基因轉(zhuǎn)染后48h轉(zhuǎn)染組、空載體轉(zhuǎn)染組、未轉(zhuǎn)染組的細(xì)胞上清及基因轉(zhuǎn)染后l周的細(xì)胞上清對(duì)大鼠腎微血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)增殖的影響。并檢測(cè)基因轉(zhuǎn)染后細(xì)胞在不同條件培養(yǎng)下ALP及OCN表達(dá)分泌量?！　〗Y(jié)果：體外分離、培養(yǎng)出的大鼠腎微血管內(nèi)皮細(xì)胞第Ⅷ因子相關(guān)抗原陽(yáng)性?；蜣D(zhuǎn)染組細(xì)胞上清能明顯促進(jìn)大鼠腎微血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖，與空載體

5、轉(zhuǎn)染組、未轉(zhuǎn)染組相比有顯著性差異，基因轉(zhuǎn)染后1周比轉(zhuǎn)染后48h的細(xì)胞上清更能促進(jìn)MVEC的增殖，兩者有顯著性差異。在成骨條件培養(yǎng)下，基因轉(zhuǎn)染組細(xì)胞ALP和OCN的表達(dá)分泌量明顯高于空載體轉(zhuǎn)染組和未轉(zhuǎn)染組，而在正常條件培養(yǎng)下，基因轉(zhuǎn)染組細(xì)胞ALP和OCN的表達(dá)分泌量較低?！　〗Y(jié)論：　　1．在體外能成功的分離、培養(yǎng)出大鼠腎微血管內(nèi)皮細(xì)胞?！　?．基因修飾后的BMSCs所分泌的VEGF蛋白能促進(jìn)MVEC增殖，并且呈劑量依賴性?！　?．

6、成骨培養(yǎng)條件下，VEGFl65基因轉(zhuǎn)染能促進(jìn)BMSCs體外成骨能力?！　∪?、轉(zhuǎn)染后BMSOs與納米級(jí)人T骨復(fù)合培養(yǎng)及其在裸鼠體內(nèi)血管化及異位成骨的研究?！　∧康模河^察VEGFl65基因轉(zhuǎn)染后BMSCs與納米級(jí)人工骨(NHAC)體外復(fù)合培養(yǎng)及其植入裸鼠體內(nèi)后人工骨血管化和成骨情況?！　》椒ǎ簩⒒蜣D(zhuǎn)染后的BMSCs與納米級(jí)人工骨復(fù)合培養(yǎng)，通過(guò)掃描電鏡觀察其在人工骨上生長(zhǎng)情況。將此復(fù)合物植入裸鼠體內(nèi)，4周后組織形態(tài)學(xué)觀察其在體內(nèi)血管化

7、及異位成骨的情況。　　結(jié)果：基因轉(zhuǎn)染后BMSCs能在納米級(jí)人工骨表面生長(zhǎng)、增殖。植入體內(nèi)后組織學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)基因轉(zhuǎn)染后BMSCs與納米級(jí)人工骨復(fù)合有較多新生血管和新骨形成。　　結(jié)論：　　1．基因轉(zhuǎn)染后BMSCs與納米級(jí)人工骨具有良好的生物相容性?！　?．轉(zhuǎn)染后的BMSCs在體內(nèi)能加快人工骨血管化和促進(jìn)成骨?！　∷?、hVEGF165基因轉(zhuǎn)染酬SCs復(fù)合納米級(jí)人工骨促進(jìn)大鼠骨缺損的研究?！　∧康模河^察hVEGFl65基因轉(zhuǎn)染BMSC

8、s復(fù)合納米級(jí)人工骨對(duì)骨缺損修復(fù)的作用?！　》椒ǎ篠D大鼠造成橈骨5mm的骨缺損模型，將基因轉(zhuǎn)染的BMSCs與納米級(jí)人工骨復(fù)合培養(yǎng)后植入骨缺損處，分別于術(shù)后4、8、12周通過(guò)墨汁灌注法、組織學(xué)切片以及X線檢測(cè)，在12周時(shí)還進(jìn)行骨密度、生物力學(xué)檢測(cè)，觀察骨缺損修復(fù)情況。　　結(jié)果：基因轉(zhuǎn)染的BMSCs與納米級(jí)人工骨復(fù)合植入體內(nèi)后，毛細(xì)血管、骨小梁形成比其它組要多、要早，BMI)、生物力學(xué)、X線檢測(cè)結(jié)果顯示新生骨質(zhì)量較高，骨缺損修復(fù)情況優(yōu)于