血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子165基因轉(zhuǎn)染人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞構(gòu)建組織工程皮膚的實驗研究.pdf

1、嚴(yán)重創(chuàng)傷、大面積燒傷、腫瘤摘除、整形術(shù)后的創(chuàng)面覆蓋一直是困擾臨床醫(yī)生的難題。目前常規(guī)的治療方法有自體、異體或異種皮移植。自體皮膚來源極為有限，而且存在著形成新創(chuàng)面的缺陷；異體或異種皮膚移植解決了自體皮源不足的問題，但由于難以克服的免疫排斥反應(yīng)，目前只能用作暫時封閉創(chuàng)面的覆蓋物。近年來，組織工程皮膚的構(gòu)建與應(yīng)用為皮膚缺損的修復(fù)提供了極具發(fā)展?jié)摿Φ闹委熗緩?。但現(xiàn)階段各種組織工程化皮膚移植存活率明顯低于自體斷層皮片，其首要原因之一是組織工程化

2、皮膚移植后缺乏足夠的血管化而導(dǎo)致低灌注和缺血損傷。因此，如何促進移植皮膚的血管化，成為組織工程皮膚臨床推廣應(yīng)用研究的關(guān)鍵。 研究表明，利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)，將血管生成調(diào)控因子基因?qū)肽康募?xì)胞，使其表達(dá)某些調(diào)控因子，可有效促進血管生成。 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（bone mesenchymal stem cells，MSCs）是一種具有多向分化潛能的成體干細(xì)胞，在不同的誘導(dǎo)條件下可向骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞、肌細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞等各種細(xì)

3、胞系轉(zhuǎn)化，由于骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞屬未分化的前體干細(xì)胞，表型分化尚不成熟，免疫原性小，所以移植后無排斥反應(yīng)或反應(yīng)較弱，而且，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞還具有取材方便、體外擴增容易、體外增殖能力強、易于基因操作等獨特的優(yōu)點，逐漸成為基因治療適宜的細(xì)胞載體。血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子（Vascular endothelial growth factor，VEGF）是目前已知的最強的促血管再生因子，近年來應(yīng)用血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子165基因（VEGF165）轉(zhuǎn)染骨

4、髓間充質(zhì)干細(xì)胞，用于心肌缺血或肢體缺血性疾病的實驗及臨床研究已取得了令人矚目的成就，但將其應(yīng)用于組織工程皮膚構(gòu)建的研究尚未見報道，因此，采用基因轉(zhuǎn)移技術(shù)將hVEGF165基因轉(zhuǎn)入骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞中，使其有效表達(dá)目的基因和蛋白，構(gòu)建活性組織工程皮膚，植入皮膚創(chuàng)面后使骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞在局部短期內(nèi)分泌VEGF蛋白，從而促進組織工程皮膚的早期血管化，有可能為解決組織工程皮膚血管化這一問題提供新的方法與思路。 本研究采用脂質(zhì)體介導(dǎo)hVEG

5、F165基因轉(zhuǎn)染人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，觀察VEGF165基因mRNA轉(zhuǎn)錄、蛋白的表達(dá)情況及轉(zhuǎn)染后對骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的影響，并接種轉(zhuǎn)染VEGF165基因的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞于同種異體脫細(xì)胞真皮支架上構(gòu)建VEGF基因修飾的活性皮膚替代物，移植修復(fù)動物全層皮膚缺損創(chuàng)面，觀察其在皮膚結(jié)構(gòu)和功能重建中的作用及其轉(zhuǎn)歸，比較缺損創(chuàng)面移植皮膚的血管化情況，為加速組織工程皮膚移植后血管化、提高其臨床移植成功率探索新的途徑。 基于這種認(rèn)識，我們開展了以

6、下一系列研究： 第一部分人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的分離、培養(yǎng)和鑒定 目的：建立一種分離純化和培養(yǎng)入骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的方法，為利用骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞進行基因治療提供實驗基礎(chǔ)。 方法密度梯度離心和貼壁培養(yǎng)相結(jié)合，分離純化人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞。倒置相差顯微鏡下觀察人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化；流式細(xì)胞儀檢測人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的表面標(biāo)記以及細(xì)胞周期；繪制人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的生長曲線；透射電鏡觀察人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)。

7、 結(jié)果：密度梯度離心結(jié)合貼壁法能分離培養(yǎng)出純度較高的人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞。流式細(xì)胞儀檢測人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞CD90、CD29、CD44、CD34、CD45陽性表達(dá)細(xì)胞比率分別為98.48％、98.74％、97.41％、0.36％、0.64％。人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的生長曲線呈S形。透射電鏡示細(xì)胞核漿比大，可見部分細(xì)胞器和蛋白分泌物。 結(jié)論：采用密度梯度離心和貼壁培養(yǎng)相結(jié)合，可獲得純度較高和活性骨髓MSC，是簡便有效實用可行的方法。

8、 第二部分血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子165基因轉(zhuǎn)染人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的實驗研究 目的：觀察人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞轉(zhuǎn)染VEGF165基因后外源性基因及其蛋白的表達(dá)，探討其促進組織工程皮膚移植后血管化的可能性。 方法：體外分離、培養(yǎng)人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，采用脂質(zhì)體介導(dǎo)方法將pShuttle-CMV/VEGF165質(zhì)粒轉(zhuǎn)染人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，并設(shè)立空質(zhì)粒對照組（轉(zhuǎn)染pShuttle-CMV載體）、脂質(zhì)體對照組（轉(zhuǎn)脂質(zhì)體）和正常對照組

9、（無特殊處理），用RT-PCR、ELISA和Western Blot檢測入骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞VEGF165 mRNA及其蛋白的表達(dá)情況，MTT法及流式細(xì)胞儀檢測VEGF質(zhì)粒轉(zhuǎn)染對骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞活性的影響。 結(jié)果：RT-PCR檢測結(jié)果顯示：質(zhì)粒轉(zhuǎn)染實驗組、空質(zhì)粒對照組、脂質(zhì)體對照組和正常對照組VEGF165基因mRNA表達(dá)量分別為0.89±0.03、0.34±0.04、0.40±0.03、0.30±0.03。質(zhì)粒轉(zhuǎn)染實驗組骨髓間充

10、質(zhì)干細(xì)胞mRNA轉(zhuǎn)錄較三個對照組均顯著上調(diào)（P<0.01）。ELISA檢測質(zhì)粒轉(zhuǎn)染實驗組、空質(zhì)粒對照組、脂質(zhì)體對照組和正常對照組處理后24h細(xì)胞上清hVEGF的濃度分別為778.39±35.21pg/ml、543.55±24.32pg/ml、561.45±28.08pg/ml、571.53±22.73pg/ml，質(zhì)粒轉(zhuǎn)染實驗組與其他對照組相比具有統(tǒng)計學(xué)差異（P<0.01）。質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后第7天表達(dá)達(dá)到最高，以后再逐漸降低。Western B

11、lot檢測結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染組條帶明顯增強（P<0.01）。MTT法及凋亡檢測結(jié)果顯示VEGF質(zhì)粒轉(zhuǎn)染對骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞增殖無影響。 結(jié)論：實現(xiàn)了VEGF165基因?qū)θ斯撬栝g充質(zhì)干細(xì)胞的成功轉(zhuǎn)染，并有效表達(dá)目的基因及其蛋白，具有促進組織工程皮膚移植后血管化的應(yīng)用前景。 第三部分血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子165修飾骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞復(fù)合脫細(xì)胞真皮基質(zhì)構(gòu)建活性組織工程皮膚 目的：以VEGF修飾的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞復(fù)合脫細(xì)胞真皮基質(zhì)構(gòu)

12、建活性組織工程皮膚，為進一步臨床應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。 方法：體外培養(yǎng)人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，以脂質(zhì)體介導(dǎo)pShuttle-CMV/VEGF165質(zhì)粒轉(zhuǎn)染骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞后，將其接種于制備好的脫細(xì)胞真皮支架上，構(gòu)建組織工程皮膚，觀察細(xì)胞生長情況及其與支架材料的相容性。 結(jié)果：脫細(xì)胞真皮基質(zhì)去細(xì)胞完全，組織相容性好，轉(zhuǎn)基因骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞在脫細(xì)胞真皮基質(zhì)中生長良好，可體外構(gòu)建組織工程皮膚。 結(jié)論：利用VEGF修飾骨髓間充質(zhì)干細(xì)

13、胞及制備的脫細(xì)胞真皮基質(zhì)可以體外聯(lián)合構(gòu)建活性組織工程皮膚。 第四部分含基因骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的活性皮膚移植促進組織工程皮膚血管化的初步研究 目的：探討含基因骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的活性皮膚移植促進組織工程皮膚血管化的基因治療的可行性。 方法：新西蘭白兔26只，于兔背部兩側(cè)常規(guī)全層皮膚缺損創(chuàng)面4個，隨機分為四組：A組（以含VEGF基因骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞復(fù)合脫細(xì)胞真皮構(gòu)建的組織工程皮膚修復(fù)創(chuàng)面，hVEGF165-MSCs+AD

14、M實驗組），B組（以骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞復(fù)合脫細(xì)胞真皮構(gòu)建的組織工程皮膚修復(fù)創(chuàng)面，MSCs+ADM對照組），C組（以不含細(xì)胞的脫細(xì)胞真皮修復(fù)創(chuàng)面，單純ADM對照組）和D組（創(chuàng)面不做處理），觀察局部組織微血管密度變化及創(chuàng)面愈合情況。 結(jié)果：移植術(shù)后一周，hVEGF165-MSCs+ADM實驗組創(chuàng)面的毛細(xì)血管密度較MSCs+ADM對照組、單純ADM對照組明顯增高（P<0.01），兩周時三組中hVEGF165-MSCs+ADM實驗組的血管