血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子基因轉(zhuǎn)染骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞治療缺血性心臟病的研究.pdf

1、盡管傳統(tǒng)血運(yùn)重建術(shù)取得了巨大進(jìn)展，但缺血性心臟病的治療仍然存在諸多不足。治療性血管生成(therapeuticangiogenesis)通常所采用的兩種方法，包括直接注射重組成血管因子的蛋白療法和基于傳遞編碼成血管因子基因的基因療法。在眾多的成血管因子中，血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascularendothelialgrowthfactor,VEGF)由于其在血管生成中的關(guān)鍵作用而被廣泛研究，并且VEGF還表現(xiàn)出對(duì)心肌缺血損傷的保護(hù)作用。近來(lái)

2、細(xì)胞移植促進(jìn)血管生成研究是對(duì)治療性血管生成方法的有效補(bǔ)充。骨髓來(lái)源的間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymalstemcells，MSCs)具有分化包括心肌細(xì)胞，內(nèi)皮細(xì)胞在內(nèi)的多種細(xì)胞的能力。并且，MSCs易于從骨髓中分離培養(yǎng)，體外擴(kuò)增，是較為理想的種子細(xì)胞。在梗死心肌和缺血骨骼肌進(jìn)行成肌細(xì)胞介導(dǎo)的成血管基因傳送能同時(shí)獲得肌肉生成和血管生成，因此被視為一種極具潛能的替代療法。 在這些研究的基礎(chǔ)上，我們假設(shè)VEGF基因轉(zhuǎn)染的MSCs移植

3、能有效增強(qiáng)缺血心肌的成肌和血管生成效應(yīng)，進(jìn)而導(dǎo)致心功能顯著改善。為驗(yàn)證該假設(shè)，并為該方法的臨床運(yùn)用進(jìn)一步做出鋪墊性實(shí)驗(yàn)論證，我們進(jìn)行了如下研究，共分為三部分： 第一部分：VEGF真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1(-)/hVEGF165的構(gòu)建及鑒定目的：構(gòu)建并鑒定VEGF真核表達(dá)載體pcDNA3.1(-)/hVEGF165。 方法：運(yùn)用基因重組技術(shù)，構(gòu)建重組質(zhì)粒pcDNA3.1(-)/hVEGF165，并對(duì)其進(jìn)行酶切鑒定，DN

4、A序列測(cè)定。 結(jié)果：成功構(gòu)建重組質(zhì)粒pcDNA3.1(-)/hVEGF165。 第二部分：VEGF真核表達(dá)載體轉(zhuǎn)染MSCs及其表達(dá)目的：研究VEGF真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1(-)/hVEGF165體外轉(zhuǎn)染MSCs及VEGF在MSCs中的表達(dá)情況。 方法：體外分離、培養(yǎng)大鼠MSCs，對(duì)其進(jìn)行表型及生長(zhǎng)曲線(xiàn)測(cè)定。通過(guò)脂質(zhì)體介導(dǎo)技術(shù)將pcDNA3.1(-)/hVEGF165轉(zhuǎn)染MSCs，Western-blot，R

5、T-PCR，ELISA及免疫細(xì)胞化學(xué)等方法檢測(cè)VEGF在MSCs中的表達(dá)情況，MTT法檢測(cè)轉(zhuǎn)染后細(xì)胞上清液中VEGF的生物活性。 結(jié)果：體外培養(yǎng)MSCs呈典型成纖維細(xì)胞樣外觀，表面分子標(biāo)記物表達(dá)CD44(96±0.5％)，CD90(98.5±0.2％)，CD34(5±0.2％)和CD45(1±0.3％)。Western-blot，RT-PCR檢測(cè)轉(zhuǎn)染MSCs表達(dá)VEGF蛋白和mRNA，ELISA檢測(cè)轉(zhuǎn)染組細(xì)胞上清VEGF表達(dá)顯著

6、增加(p＜0.05)，MTT法檢測(cè)轉(zhuǎn)染組細(xì)胞上清能顯著促進(jìn)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞增殖(p＜0.05)，免疫細(xì)胞化學(xué)染色結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染組VEGF陽(yáng)性細(xì)胞明顯增多。 第三部分：VEGF基因轉(zhuǎn)染MSCs移植治療缺血性心臟病的研究目的：研究VEGF基因轉(zhuǎn)染的MSCs移植對(duì)缺血心肌的成肌和成血管效應(yīng)。 方法：60只近交系Wistar大鼠隨機(jī)均分為以下四組：VEGF基因轉(zhuǎn)染MSCs移植組(MSCs/VEGF組)，MSCs移植組(MSCs組)

7、，pcDNA3.1(-)/hVEGF165注射組(VEGF組)，無(wú)血清培養(yǎng)基注射對(duì)照組(Control組)，結(jié)扎前降支建立急性心梗模型后在梗死區(qū)邊緣區(qū)行8×106/30μl細(xì)胞移植，VEGF組行300μg/30μl質(zhì)粒注射，對(duì)照組行等量無(wú)血清培養(yǎng)基注射。細(xì)胞移植前行CM-DiI標(biāo)記。移植30d后行組織化學(xué)檢測(cè)平均再生血管密度，梗死面積，移植MSCs分化情況，心臟B超、血流動(dòng)力學(xué)參數(shù)測(cè)定檢測(cè)心臟功能。 結(jié)果：30d后MSCs/VE

8、GF組與MSCs組，VEGF組，Control組比較，平均再生血管密度，梗死面積，B超心臟功能測(cè)定，血流動(dòng)力學(xué)參數(shù)測(cè)定均有顯著改善(p＜0.001)。移植MSCs在局部可分化為desmin(+)，cTnT(+)細(xì)胞，表現(xiàn)出心肌細(xì)胞顯型。極少數(shù)移植MSCs參與新生血管生成，新生血管成分絕大多數(shù)為宿主源性。 結(jié)論：1、成功構(gòu)建重組質(zhì)粒pcDNA3.1(-)/hVEGF165。 2、pcDNA3.1(-)/hVEGF165轉(zhuǎn)染

9、大鼠MSCs后能有效增加VEGF表達(dá)，并表現(xiàn)出較強(qiáng)的促內(nèi)皮細(xì)胞增殖作用。 3、MSCs易于分離培養(yǎng)，體外擴(kuò)增。 4、VEGF基因轉(zhuǎn)染MSCs移植治療能顯著促進(jìn)缺血心肌新生血管再生，但只有極少數(shù)移植MSCs參與新生血管生成，新生血管成分絕大多數(shù)為宿主源性。 5、移植pcDNA3.1(-)/hVEGF165轉(zhuǎn)染的MSCs在缺血心肌可橫向分化為心肌細(xì)胞，表現(xiàn)出心肌細(xì)胞顯型，并能在一定程度上防止心室重塑。 6、V