纖維蛋白基質承載的IGF-I基因修飾骨髓間充質干細胞移植治療缺血性心臟病的研究.pdf

1、近年來，干細胞移植修復損傷心肌一直是基礎和臨床研究的熱點。骨髓間充質干細胞(Mesenchymal stem cells，MSCs)因為具有來源廣泛、取材方便、無免疫原性以及不涉及倫理問題等優(yōu)點在缺血性心臟病的治療中應用最為廣泛。胰島素樣生長因子-Ⅰ(Insulin-like growth factor-Ⅰ，IGF-Ⅰ)是胰島素家族的一種單鏈多肽類生長因子，作為生長因子生物學效應的主要介質，IGF-Ⅰ在調(diào)節(jié)細胞增殖、分化及抑制細胞凋亡、

2、壞死等方面具有重要作用。以往的研究表明，對小動物心梗模型單獨或聯(lián)合應用MSCs和IGF-Ⅰ進行治療，均可不同程度的改善心肌梗死后的心功能。但將MSCs與IGF-Ⅰ聯(lián)合應用于和人類更為接近的大動物模型研究甚少，療效尚不明確。并且，如何最有效地將干細胞與細胞因子聯(lián)合起來，如何最大程度提高細胞移植手術安全性等問題也并不十分明了，而這恰恰正是關系到細胞治療最終能否為臨床所用的關鍵問題。因此本研究在對豬心梗模型進行優(yōu)化的基礎上，綜合運用基因工程和

3、組織工程技術，以多孔纖維蛋白基質為載體將IGF-Ⅰ過表達MSCs穩(wěn)轉細胞株移植到豬的梗死心肌，觀察其對梗死后心臟功能的影響以及在梗死心肌修復等方面的作用，并對其作用機制進行初步探討。本文南四部分組成:
　　第一部分豬骨髓間充質干細胞的分離及鑒定
　　目的:研究豬骨髓間充質干細胞(MSCs)體外分離培養(yǎng)及向心肌細胞定向誘導分化的方法，并對所得MSCs及其分化結果進行鑒定;為心肌梗死的干細胞治療提供種子細胞來源。
　　方法

4、:(1)采用密度梯度離心法，將MSCs從豬骨髓血液中分離出來，置于低糖DMEM中進行傳代培養(yǎng)。利用換液的方法將其純化。(2) MTT法測定細胞P2、P5、P8增殖曲線;(3)臺盼藍染色細胞活性鑒定。(4)倒置相差顯微鏡觀察其形態(tài)結構和生物學特性，通過臺盼藍染色、免疫細胞化學染色和流式細胞分選方法對其細胞膜CD44、CD90表型進行鑒定。(5)5-氮雜胞苷(5-Aza)誘導P2、P5代MSCs向心肌分化，計算心肌細胞的轉化率。
　　

5、結果:(1)通過密度梯度離心聯(lián)合貼壁篩選培養(yǎng)的方法，可以在體外分離培養(yǎng)出增殖能力強的豬MSCs，細胞生長狀態(tài)良好，各代細胞形態(tài)基本一致;原代與傳代培養(yǎng)細胞的生長曲線都為S型，但是傳代培養(yǎng)的細胞生長速度比原代快。傳代培養(yǎng)的結果顯示，在經(jīng)歷了8代培養(yǎng)以后，豬MSCs才出現(xiàn)衰老征象。與原代培養(yǎng)細胞的生長曲線相比，傳代培養(yǎng)的細胞生長潛伏期短，每代只要3～4天就可鋪滿培養(yǎng)皿底壁。(2)臺盼藍細胞活性結果:P2＞P5＞P8。(3)免疫熒光實驗結果得

6、知:CD44和CD90陽性表達率高于80％。(4)在相同濃度的5-Aza作用下，MSCs向心肌細胞的轉化率隨著傳代次數(shù)的增加逐漸降低。P2代心肌數(shù)量顯著高于P5代。
　　結論:本實驗在體外成功培養(yǎng)了豬MSCs。5-Aza體外可誘導豬MSCs分化為心肌樣細胞;P2代MSCs在濃度為10μmol/L的5-Aza作用下，誘導效果最明顯。
　　第二部分 IGF-Ⅰ慢病毒載體構建及感染豬骨髓間充質干細胞的初步研究
　　目的:構建

7、過表達和干擾IGF-Ⅰ慢病毒表達載體Lenti-IGF-Ⅰ，觀察過表達和干擾IGF-Ⅰ對5-Aza誘導骨髓問充質干細胞(MSCs)分化為心肌樣細胞的影響。
　　方法:使用工具質粒pCDH-GFP/pLKO.1-TRC和豬IGF-Ⅰ基因相連接，構建出表達融合基因GFP-IGF-Ⅰ重組質粒pCDH-GFP-IGF-Ⅰ。利用在pCDH-GFP-IGF-Ⅰ質粒的上下游引物中加入BamHI/EcoRI酶的酶切位點方法以及與Xhol酶是同尾酶

8、的特點，將融合基因GFP-IGF-Ⅰ與經(jīng)BamHI/EcoRI酶雙酶切的pCDH質粒相連接，轉化DH5α感受態(tài)細胞中，構建的重組慢病毒轉移質粒命名為pCDH-GFP-IGF-Ⅰ，轉化后挑選單克隆擴增進行PCR鑒定，正確克隆行測序鑒定。接著以脂質體轉染法分別將重組質粒pCDH-GFP-IGF-Ⅰ和包裝質粒psPAX2、包膜蛋白質粒pMD2.G共同轉染293T細胞，收獲病毒。攜帶pCDH-GFP-IGF-Ⅰ融合基因的慢病毒感染MSCs細胞后

9、，經(jīng)過熒光顯微鏡觀察綠色熒光表達情況以明確慢病毒成功感染MSCs細胞。利用熒光實時定量PCR、蛋白免疫印跡法和免疫組織化學法觀察過表達和干擾IGF-Ⅰ對5-Aza誘導MSCs分化為心肌的IGF、GATA-4、NKX2.5、β-MHC和MEF-2c的變化。
　　結果:通過PCR和測序鑒定重組質粒pCDH-GFP-IGF-Ⅰ構建正確。重組質粒pCDH-GFP-IGF-Ⅰ的PCR結果應為GFP-IGF-Ⅰ融合基因片段大小約393bp，與

10、雙酶切pCDH-GFP-IGF-Ⅰ釋放出的片段大小一致，證明了融合基因成功插入pCDH質粒中。包裝帶有豬IGF-Ⅰ基因序列的慢病毒并感染靶細胞，經(jīng)過熒光顯微鏡觀察，感染成功并且感染效率可達80％。熒光實時定量PCR、蛋白免疫印跡法和免疫組織化學法結果得出，過表達IGF-Ⅰ的MSCs細胞組IGF、GATA-4、NKX2.5、β-MHC和MEF-2c表達量顯著高于其他組，siRNA-IGF-Ⅰ的MSCs細胞組各指標顯著低于其他組。
　

11、　結論:成功構建了豬IGF-Ⅰ慢病毒表達載體Lenti-IGF-Ⅰ，MSCs細胞高表達IGF-Ⅰ時有利于向心肌分化。
　　第三部分豬心肌梗死/再灌注后左室重構模型的改進及其評價
　　目的:評價采用阻斷鈍緣支和/或對角支建立豬急性心肌梗死/再灌注后左室重構模型的有效性和穩(wěn)定性。
　　方法:40只上海白豬隨機分為3組;其中假手術組（Shame組）10只，改良組（OPTI組）和LAD組各15只。所有動物術前行心臟核磁共振(M

12、RI)檢查，記錄基礎數(shù)據(jù)。全麻氣管插管后，經(jīng)左側第四肋間進胸，改良組采用選擇性阻斷左冠狀動脈鈍緣支和/或對角支;LAD組采用阻斷左冠狀動脈前降支遠端1/3處，引起急性心肌梗死，阻斷60分鐘后，解除阻斷恢復心肌血供;假手術組僅開胸觀察60分鐘后常規(guī)關胸。術中全程監(jiān)測并記錄心電圖及血流動力學指標。存活動物術后4周復查MRI、記錄血流動力學指標后處死。比較各組間解剖數(shù)據(jù)、血流動力學指標。比較改良組和LAD組手術死亡率、惡性心律失常發(fā)生率的差別

13、;比較兩組經(jīng)過MRI檢測所得出的左室射血分數(shù)(LVEF)變異度，收縮期室壁增厚率(STF)、收縮室壁張力(SWS)變異度及心梗面積(SS)變異度，進而判斷改良法建立豬急性心梗模型的優(yōu)劣。
　　結果:改良組3例術中發(fā)生室顫(20％)，2例死亡(13％);LAD組6例術中出現(xiàn)室顫(40％)，5例死亡(33％)。與對照組相比，手術4周后改良組和LAD組均有明顯的梗死瘢痕形成，出現(xiàn)明顯的梗死后代償性左心室重構。MRI檢測結果顯示兩模型組整

14、體心功能均較假手術組有明顯下降。改良組在梗死面積(SS)、和整體心功能(LVEF)方面的變異程度極顯著低于LAD組(P＜0.01)，但兩組間局部室壁收縮功能指標STF和SWS無顯著性差異（P＞0.05）。
　　結論:冠狀動脈左前降支(LAD)供血范圍大，而且變異較多，以往使用的LAD結扎建立心梗模型的方法不僅死亡率高，而且所建模型穩(wěn)定性差。采用選擇性阻斷左冠狀動脈鈍緣支(OM)和/或對角支(D)血供的改良法可成功建立梗死后/再灌注

15、左心室重構模型。改良法建模不僅手術成功率更高，而且所建模型在梗死面積、左室整體收縮功能等方面的變異度均明顯優(yōu)于左前降支結扎法，為進一步評價干細胞對大動物急性心梗的治療作用打下了堅實的基礎。
　　第四部分多孔纖維蛋白基質承載的IGF-Ⅰ基因修飾MSCs移植對豬心肌梗死的治療作用及其機制
　　目的:探討以多孔纖維蛋白基質為載體行IGF-Ⅰ基因修飾MSCs移植對豬心肌梗死的治療作用和機制。
　　方法:將從豬骨髓中分離出的間充

16、質干細胞(MSCs)經(jīng)基因修飾后分為僅GFP陽性表達之MSCs(cMSCs)、IGF-Ⅰ干擾MSCs(siMSCs)及IGF-Ⅰ過表達MSCs(oeMSCs)，將這些MSCs用于豬心肌梗死模型，測試其療效。2～3月齡雌性上海白豬31頭，體重22～28kg，術前行MR掃描測定基礎心功能數(shù)據(jù)。以改良法選擇性阻斷左冠狀動脈系統(tǒng)左室面分支60min后恢復血供，建立急性心肌梗死/再灌注模型?；謴脱?5分鐘后將存活動物隨機分為4組:對照組(MI，

17、n=7)、eMSCs移植組(MI+cMSCs，n=7)、siMSCs移植組(MI+si-IGF-Ⅰ- MSCs，n=7)及oeMSCs移植組(MI+OE-IGF-Ⅰ-MSCs，n=7)。將包裹移植細胞的纖維蛋白基質粘附于各細胞移植組梗死區(qū)心外膜表面，將纖維蛋白基質包裹等量細胞培養(yǎng)液粘附于對照組病變處。分別于術后1周和4周行MRI檢查，評估左室整體收縮功能(LVEF)、梗死節(jié)段心肌局部收縮功能(STF)，測量心梗面積(SS)和心室容積，計

18、算室壁張力(SWS);比較各細胞移植組治療效果。術后第4周MR檢查后，對動物實施安死術，完成組織取材。通過組織學觀察、免疫熒光染色、免疫組化、Western blot等技術從干細胞遷移分化，新生血管形成以及增殖相關指標IGF、Bcl-2和凋亡相關因子BAX表達情況等方面對IGF-Ⅰ修飾MSCs移植后的作用機制進行研究。
　　結果:MR檢測發(fā)現(xiàn)，從術后1周起細胞移植組的LVEF和STF即較對照組有顯著改善(P＜0.05)，此種改善可

19、延續(xù)至術后4周，術后4周時oeMSCs組梗死面積和梗死邊緣區(qū)STF明顯優(yōu)于siMSCs組;術后4周時，細胞移植組反應左室重構程度指標(LVW/BW)顯著優(yōu)于對照組(P＜0.05)，細胞移植組的收縮室壁張力(SWS)亦顯著低于對照組（P＜0.05）。手術4周后，組織學觀察發(fā)現(xiàn)病變心肌心外膜緣仍有纖維蛋白基質附著;免疫熒光染色不僅證實細胞移植區(qū)仍有MSCs存活，還在梗死邊緣區(qū)發(fā)現(xiàn)已有少量MSCs分化為心肌樣細胞或與自體心肌發(fā)生細胞融合。oe

20、MSCs組在梗死及邊緣區(qū)血管密度均顯著高于其他各組(P＜0.05)。免疫組化及Western blot檢測統(tǒng)計結果得知，過表達組IGF蛋白表達量顯著高于其他各組(P＜0.05);Bcl-2和CD31蛋白表達量與IGF表達趨勢是一致的，而凋亡相關蛋白BAX表達趨勢與IGF恰相反。
　　結論:多孔纖維蛋白基質是干細胞移植的優(yōu)良載體，MSCs移植可有效改善心肌梗死后的左室重構，明顯提高心功能，IGF-Ⅰ過表達修飾的MSCs治療效果優(yōu)于單