Bcl-2基因修飾的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞對(duì)神經(jīng)細(xì)胞缺血性損傷的保護(hù)作用.pdf

1、目的：
　　 缺血性腦血管病是威脅人類健康的三大疾病之一,具有發(fā)病率、死亡率、致殘率及復(fù)發(fā)率高的特點(diǎn),給家庭和社會(huì)帶來(lái)沉重的精神和經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。超早期溶栓治療雖然證實(shí)有效,卻受到治療時(shí)間窗(3-6小時(shí))和易誘發(fā)腦出血等副作用的限制,目前急需尋找新的治療途徑。干細(xì)胞移植作為一種不同于傳統(tǒng)治療的全新方法可以重塑受損的神經(jīng)元通路和改善神經(jīng)功能缺失,已成為缺血性腦血管病治療方面的研究熱點(diǎn)。近年來(lái),用于治療缺血性腦血管病的干細(xì)胞包括神經(jīng)干細(xì)胞

2、(neuralstem cell,NSC)和骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow-derived mesenchymal stem cells,MSCs)。神經(jīng)干細(xì)胞來(lái)源于人的腦組織或人胚胎干細(xì)胞,受到醫(yī)學(xué)倫理限制,不適合自體移植。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞,是來(lái)源于骨髓的一種具有自我復(fù)制和多向分化潛能的非造血干細(xì)胞,不僅可以分化為骨、軟骨、脂肪等間質(zhì)細(xì)胞,在適宜的條件下,還能分化為神經(jīng)細(xì)胞。與NSC相比,MSCs具有以下特點(diǎn):(1)容易獲取

3、,來(lái)源豐富,不存在倫理學(xué)爭(zhēng)議;(2)可自體移植,避免了免疫排斥反應(yīng);(3)體外容易擴(kuò)增,能穩(wěn)定、高效的表達(dá)外源基因。所以MSCs更適合用于缺血性腦血管病的干細(xì)胞移植治療。而MSCs移植入體內(nèi)后的低成活率限制了其應(yīng)用。Chen等研究發(fā)現(xiàn),MSCs的神經(jīng)細(xì)胞轉(zhuǎn)化率在體外可高達(dá)80％,而在體內(nèi)僅約為3～10％,其原因雖然復(fù)雜,但主要是MSCs移植至體內(nèi)后,其自身發(fā)生凋亡所致。因此,如何減少其移植后凋亡的發(fā)生,提高M(jìn)SCs在體內(nèi)的存活率及向神經(jīng)

4、細(xì)胞定向分化的能力是目前干細(xì)胞移植治療腦缺血亟待解決的主要問(wèn)題。Bcl-2基因(Bcell lymphoma/leukemia gene2,Bcl-2 gene)是目前研究較為明確的抗凋亡基因。如果將Bcl-2基因轉(zhuǎn)染到MSCs,可能會(huì)減少移植后的MSCs的凋亡,提高M(jìn)SCs的存活率,從而解決這一難題。最近國(guó)外學(xué)者Li等將Bcl-2基因修飾的MSCs移植入心肌梗死大鼠模型,發(fā)現(xiàn)Bcl-2能夠增加移植后的MSCs的存活率,并且不影響MSC

5、s的多向分化潛能,心肌梗死灶周圍的毛細(xì)血管密度增加15％,心肌梗死病灶縮小17％,心肌功能得到明顯改善。目前國(guó)內(nèi)外尚無(wú)移植Bcl-2基因修飾的MSCs治療腦缺血的相關(guān)報(bào)道,故本課題組擬將Bcl-2基因在體外轉(zhuǎn)染至MSCs,進(jìn)一步擬研究Bcl-2基因轉(zhuǎn)染的MSCs是否能夠提高M(jìn)SCS的抗凋亡能力,及在體外是否具有向神經(jīng)細(xì)胞分化的潛能。總之,為尋找簡(jiǎn)便、快捷、安全、有效的治療腦缺血的方法,本課題組擬采用慢病毒載體,在體外將抗凋亡基因Bcl-

6、2轉(zhuǎn)染至MSCs,探索提高外源性MSCs移植到體內(nèi)的存活率的新方法。從而為今后臨床應(yīng)用MSCs治療缺血性腦血管病打下堅(jiān)實(shí)的理論和實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ),為治療該病開辟一條新的有效途徑。
　　 方法：
　　 根據(jù)小鼠Bcl-2基因序列設(shè)計(jì)引物,在5’端分別加上attB1和attB2位點(diǎn),以小鼠cDNA為模板,上述設(shè)計(jì)引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR產(chǎn)物通過(guò)電泳檢測(cè)后進(jìn)行回收,純化,BP結(jié)合反應(yīng).構(gòu)建pDOWN-mBcl-2載體,pDOWN-m

7、Bel-2載體的轉(zhuǎn)化和檢測(cè),LR結(jié)合反應(yīng).構(gòu)建pLV/EXPN2-Puro-EF1A-mBcl-2表達(dá)載體,及其轉(zhuǎn)化和檢測(cè),慢病毒包裝。測(cè)定Neomycin和Puromycin對(duì)F344大鼠MSCs的最適篩選濃度,攜帶eGFP慢病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)F344大鼠MSCs,Neo篩選成功轉(zhuǎn)導(dǎo)的MSCs,攜帶mBc-12慢病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)MSCs-eGFP,puro篩選成功轉(zhuǎn)導(dǎo)的MSCs,擴(kuò)增轉(zhuǎn)導(dǎo)后的MSCs,RT-PCR法檢測(cè)轉(zhuǎn)染后Bcl-2的表達(dá),采用血清剝

8、奪和缺氧(SOD)處理建立MSCs體外模擬缺血性損傷模型,通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)評(píng)價(jià)轉(zhuǎn)導(dǎo)Bcl-2基因的MSCs(Bcl-2-MSCs)和未轉(zhuǎn)染的MSCs的凋亡及存活情況。對(duì)Bcl-2-MSCs行神經(jīng)誘導(dǎo)及檢測(cè)。大鼠新生鼠海馬神經(jīng)元細(xì)胞原代分離及培養(yǎng),Bcl-2-MSCs與海馬神經(jīng)元共培養(yǎng),觀察Bcl-2-MSCs對(duì)海馬神經(jīng)元缺氧的保護(hù)作用。
　　 結(jié)果：
　　 以小鼠Bcl-2基因cDNA為模板,經(jīng)測(cè)序證實(shí)構(gòu)建慢病毒載體成功,

9、puro篩選出成功轉(zhuǎn)導(dǎo)Bcl-2基因的MSCs,Bcl-2-MSCs可穩(wěn)定、高效的表達(dá)Bcl-2蛋白;流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)顯示和MSCs相比,轉(zhuǎn)染Bcl-2基因的MSCs在SOD后凋亡細(xì)胞較少,存活細(xì)胞較多,細(xì)胞凋亡率下降,兩者比較具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.01)。轉(zhuǎn)導(dǎo)Bcl-2基因的MSCs仍具有向神經(jīng)細(xì)胞分化的潛能,未發(fā)現(xiàn)Bel.2-MSCs異常增生。Bcl-2-MSCs、MSCs與海馬神經(jīng)元共培養(yǎng),能有效的保護(hù)海馬神經(jīng)元,抑制其凋亡,降低

10、凋亡率,與對(duì)照組(單純培養(yǎng)的海馬神經(jīng)元)比,凋亡率下降具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.01)。Bcl-2-MSCs組較MSCs組凋亡率下降明顯,兩者比較具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.01)。
　　 結(jié)論：
　　 1、慢病毒載體法可穩(wěn)定高效的轉(zhuǎn)導(dǎo)Bcl-2基因到MSCs,獲得Bcl-2-MSCs穩(wěn)定表達(dá)載體。
　　 2、Bcl-2-MSCs能高效表達(dá)Bcl-2基因,提高Bcl-2-MSCs自身抗凋亡能力。
　　 3、Bc