環(huán)孢素A、胰島素對(duì)鏈脲佐菌素誘導(dǎo)的糖尿病大鼠骨轉(zhuǎn)換及其分子機(jī)制影響的研究.pdf

1、環(huán)孢素 A、胰島素對(duì)鏈脲佐菌素誘導(dǎo)的糖尿病大鼠骨轉(zhuǎn)換及其分子機(jī)制影響的研究我們近幾年在臨床上開展的腎活檢、皮膚活檢和肌肉活檢都證明，糖尿病人體內(nèi)存在廣泛的多器官免疫損傷。多年來，糖尿病的防治都是以高血糖為中心的治療策略，因此糖尿病的慢性并發(fā)癥的發(fā)病機(jī)理和臨床處理都處于思想茫然和束手無策的尷尬境地。為弄清糖尿病發(fā)病機(jī)制，更好地從疾病的源頭預(yù)防和治療糖尿病及其并發(fā)癥，作者開展了糖尿病多器官的病理免疫學(xué)的研究并嘗試用環(huán)孢素A進(jìn)行干預(yù)。本實(shí)驗(yàn)是

2、整個(gè)研究的一部分。 第一部分 環(huán)孢素A、胰島素對(duì)鏈脲佐菌素誘導(dǎo)的糖尿病(DM)大鼠骨轉(zhuǎn)換影響的研究 目的：1型DM(T1DM)是因胰島素絕對(duì)缺乏引起的以高血糖為特征的一組綜合征。其慢性并發(fā)癥包括長時(shí)間的慢性骨丟失。既往關(guān)于T1DM骨丟失的機(jī)制研究表明骨形成減低，而關(guān)于骨吸收變化研究結(jié)果不一，多數(shù)研究提示，骨吸收減低或無變化，但關(guān)于晚期糖基化終末產(chǎn)物(AGEs)作用的研究表明，AGEs主要是刺激骨吸收，故DM骨丟失的機(jī)制有

3、待進(jìn)一步研究。CsA(CsA)是一種免疫抑制劑，可用于器官移植后的抗排斥反應(yīng)和許多免疫性疾病，包括T1DM早期。隨著DM 腎病腎移植患者增加，CsA 的使用逐漸增多。因此，我們以鏈脲佐菌素(STZ)誘導(dǎo)的DM大鼠為模型，觀察其骨量和骨轉(zhuǎn)換的變化情況以及胰島素、CsA 干預(yù)的影響，同時(shí)CsA對(duì)于正常大鼠骨量和骨轉(zhuǎn)換的影響。 方法：62只雄性SD大鼠，隨機(jī)分為正常對(duì)照組(CON)、正常+低劑量CsA干預(yù)組(NL)、正常+高劑量CsA

4、干預(yù)組(NH)、單純DM組(DM)，DM+低劑量CsA 治療組(DML)，DM+高劑量CsA治療組(DMH)，胰島素治療組(INS)。以靜脈注射STZ的方法制造DM大鼠模型，各低、高劑量CsA干預(yù)組按1mg/kg/d、8mg/kg/d皮下注射 CsA，INS 組按 6U/kg/d 給予中效胰島素皮下注射，成模8周后處死。留取血尿標(biāo)本分別檢測胰島素、鈣、磷、堿性磷酸酶、骨鈣素和24小時(shí)尿鈣。留取左側(cè)脛骨近端2/3，行骨形態(tài)計(jì)量學(xué)分析。分離

5、右側(cè)股骨和椎骨(L1-5)，行骨密度測量和骨生物力學(xué)試驗(yàn)。結(jié)果：各組大鼠血鈣、磷、堿性磷酸酶水平無顯著差異。STZ誘導(dǎo)的DM大鼠24小時(shí)尿量和尿鈣顯著增加，血清骨鈣素水平減低，股骨和腰椎骨密度較正常對(duì)照組顯著減低，骨計(jì)量形態(tài)學(xué)參數(shù)顯示骨小梁骨量顯著減低，動(dòng)力學(xué)參數(shù)表明DM大鼠類骨質(zhì)表面、骨表面激活頻率、組織水平的骨形成速率顯著減低，力學(xué)測試示骨力學(xué)性能減低。胰島素干預(yù)可使DM大鼠血糖水平下降，24小時(shí)尿量和尿鈣水平減低，血清骨鈣素水平增

6、加，股骨和腰椎骨密度增加，骨力學(xué)性能改善，骨計(jì)量形態(tài)學(xué)參數(shù)顯示骨小梁骨量增加，但均未達(dá)正常對(duì)照組水平。動(dòng)力學(xué)參數(shù)表明胰島素干預(yù)可使DM大鼠類骨質(zhì)表面、骨表面激活頻率、組織水平的骨形成速率增加，可達(dá)到正常對(duì)照組水平。低劑量CsA干預(yù)正常大鼠. 結(jié)果：骨密度，骨計(jì)量學(xué)指標(biāo)、骨生物力學(xué)指標(biāo)均與正常對(duì)照組無顯著差異。高劑量CsA干預(yù)正常大鼠，不影響大鼠血糖，骨密度、骨形態(tài)學(xué)參數(shù)、骨力學(xué)指標(biāo)較正常對(duì)照組下降，同時(shí)血清骨鈣素水平、，骨動(dòng)力學(xué)

7、參數(shù)中的類骨質(zhì)表面、標(biāo)記表面、組織水平的骨形成速率較正常對(duì)照組增加。低劑量CsA干預(yù)DM大鼠，骨密度，骨計(jì)量學(xué)指標(biāo)、骨生物力學(xué)指標(biāo)均與：DM組無顯著差異。高劑量干預(yù)DM大鼠，亦不影響大鼠血糖，可使DM大鼠骨密度和表示骨小梁骨量的形態(tài)學(xué)參數(shù)和骨力學(xué)性能均進(jìn)一步減低，同時(shí)可使DM大鼠降低的血清骨鈣素水平增加，骨動(dòng)力學(xué)參數(shù)也顯示可使DM大鼠降低的骨形成速率增加。 結(jié)論：STZ誘導(dǎo)的DM大鼠骨形成速度減低造成骨量減少，骨力學(xué)性能下降。胰

8、島素治療可通過刺激骨形成，增加DM大鼠骨量，改善骨力學(xué)性能。低劑量CsA不影響正常大鼠和DM大鼠骨量、骨力學(xué)性能和骨轉(zhuǎn)換狀況。高劑量CsA干預(yù)正常大鼠可能誘發(fā)高轉(zhuǎn)換型骨量丟失和骨力學(xué)性能減低。高劑量CsA干預(yù)8周可使DM大鼠骨丟失進(jìn)一步加重，并使DM大鼠低轉(zhuǎn)換型骨丟失向高轉(zhuǎn)換型骨丟失轉(zhuǎn)變。 第二部分 環(huán)孢素A、胰島素對(duì)鏈脲佐菌素誘導(dǎo)的糖尿病大鼠骨轉(zhuǎn)換分子機(jī)制影響的研究 目的：T1DM 的一個(gè)重要的慢性并發(fā)癥就是慢性的骨丟

9、失。TlDM 導(dǎo)致骨丟失的作用機(jī)制主要是骨形成速度減慢，關(guān)于骨吸收的變化情況有待進(jìn)一步明確。本研究擬通過檢測STZ誘導(dǎo)的DM大鼠和胰島素、CsA干預(yù)后的大鼠骨組織中標(biāo)志破骨活性的核因子-κ B受體激活物配基(RANKL)/護(hù)骨素(OPG)mRNA水平和標(biāo)志成骨細(xì)胞分化晚期的骨鈣素(OC)mRNA水平，以及調(diào)控成骨細(xì)胞分化成熟的轉(zhuǎn)錄因子核結(jié)合因子1(Cbfal)、OSX mRNA 的表達(dá)水平，分析DM大鼠骨丟失的分子機(jī)制和胰島素、CsA干

10、預(yù)對(duì)其的影響。在增齡和廢用性骨質(zhì)疏松時(shí)，骨組織中脂肪組織形成增加而成骨細(xì)胞生成或成熟減少導(dǎo)致骨丟失。既往有研究顯示，STZ誘導(dǎo)的DM小鼠外周組織脂肪含量減少，但骨髓中脂肪增加伴骨量減少。因而本研究擬通過計(jì)數(shù)大鼠骨髓脂肪細(xì)胞數(shù)量，同時(shí)檢測骨組織中標(biāo)志脂肪細(xì)胞的過氧化物酶增殖激活物受體γ2(PPAR γ 2)mKNA 表達(dá)水平，證實(shí)骨量減少是否與DM狀態(tài)下這種脂肪轉(zhuǎn)移機(jī)制有關(guān)，并分析胰島素和CsA干預(yù)分別對(duì)其有何影響。 方法：實(shí)驗(yàn)動(dòng)

11、物和分組同上。分離右側(cè)脛骨近端1/3(去除骨骺)，提取骨組織總 RNA，用實(shí)時(shí)熒光定量 RT-PCR 的方法檢測大鼠骨組織中RANKL，OPG，OC，Cbfal，OSX 和 PPAR γ2 mRNA的表達(dá)水平，分離左側(cè)股骨近端1/2，制做脫鈣骨切片，計(jì)數(shù)骨髓中脂肪細(xì)胞數(shù)量。 結(jié)果：STZ誘導(dǎo)的DM大鼠骨組織中標(biāo)志骨吸收的RANKL/OPG mRNA 水平和標(biāo)志成骨細(xì)胞分化成熟晚期的OC以及調(diào)控成骨的轉(zhuǎn)錄因子 OSX、Cbfalm

12、RNA水平顯著減低，而標(biāo)志脂肪細(xì)胞的 PPAR<,γ2>mRNA 水平顯著增加，骨髓脂肪細(xì)胞計(jì)數(shù)增加伴皮下、肝臟脂肪減少。胰島素干預(yù)可使DM大鼠骨組織中OC、OSX、Cbfal mRNA 水平增加，而不影響骨組織中 RANKL/OPG mRNA 水平，同時(shí)可使DM大鼠骨組織中標(biāo)志脂肪細(xì)胞的PPAR<,γ2>mRNA水平下降，骨髓脂肪細(xì)胞計(jì)數(shù)減少。CsA 干預(yù)結(jié)果顯示，低劑量不影響正常大鼠和DM 大鼠骨組織中所研究的各因子mRNA水平和骨

13、髓脂肪細(xì)胞計(jì)數(shù)。高劑量8周可使正常大鼠和DM 大鼠骨組織中RANKL/OPG mRNA 水平和OC、OSX mRNA水平均增加，但骨組織中Cbfal mRNA 水平無顯著變化，也不影響正常和DM大鼠骨組織中標(biāo)志脂肪細(xì)胞的PPAR<,γ2> mRNA 水平和骨髓脂肪細(xì)胞計(jì)數(shù)。 結(jié)論：所研究的DM大鼠骨組織中骨吸收和骨形成的各標(biāo)志因子mRNA水平均下降，考慮為低轉(zhuǎn)換型骨量丟失。同時(shí)，骨組織中標(biāo)志脂肪細(xì)胞的PPAR<,γ2>mRNA

14、水平和骨髓脂肪細(xì)胞計(jì)數(shù)增加，而DM大鼠皮下、肝臟脂肪減少，提示這種脂肪轉(zhuǎn)移機(jī)制可能也存在于DM大鼠骨丟失過程中。胰島素干預(yù)可使DM大鼠骨組織中標(biāo)志成骨活性的各因子mRNA水平增加，而對(duì)標(biāo)志骨吸收的RANKL/OPG mRNA 水平無影響，提示胰島素主要通過刺激骨形成而非抑制骨吸收增加 DM 大鼠骨量。同時(shí)胰島素組骨組織中PPAR<,γ2> mRNA和骨髓脂肪細(xì)胞計(jì)數(shù)減少，提示胰島素可能抑制骨髓多能間充質(zhì)干細(xì)胞向脂肪細(xì)胞分化，促進(jìn)其向成骨