趨化因子受體CCR4在胃癌中的表達及相關(guān)功能研究.pdf

1、胃癌的發(fā)生與發(fā)展涉及多因素、多階段，在此過程中，趨化因子受體(chemokinereceptor)作為腫瘤發(fā)生侵襲和轉(zhuǎn)移的有利工具，對腫瘤的惡性行為起著關(guān)鍵作用。趨化因子受體是具有7次跨膜結(jié)構(gòu)域的G蛋白偶聯(lián)受體超家族成員，可表達在不同類型的細胞上。胃腫瘤細胞能表達不同的趨化因子受體，如CXCR4和CCR7，并通過這些分子發(fā)生轉(zhuǎn)移。近期研究發(fā)現(xiàn)，胃癌細胞表達CC型趨化因子受體—CCR4，并與胃癌轉(zhuǎn)移及患者預(yù)后有關(guān)，但調(diào)控其表達的關(guān)鍵因子及

2、具體機制不明。以往研究顯示，CCR4選擇性地表達在Th2型細胞及Treg細胞上，對于調(diào)節(jié)免疫平衡或抑制腫瘤免疫具有重要作用;CCR4陽性的成人T細胞白血病/淋巴瘤細胞，因具有Treg細胞樣的功能而能夠逃逸宿主免疫。雖然這些研究顯示了CCR4具有與免疫抑制相關(guān)的功能，但其研究角度一般是從該受體的趨化活性出發(fā)，且主要聚焦于免疫細胞或非實體腫瘤細胞，而關(guān)于CCR4在實體腫瘤細胞上表達的研究數(shù)據(jù)比較有限，并且CCR4自身是否具有免疫調(diào)節(jié)的功能未

3、知。另一方面，某些研究提示，腫瘤細胞不僅借助于趨化因子受體及相應(yīng)配體的相互作用獲得趨化活性而進行遷移，還可以通過該途徑上調(diào)基質(zhì)金屬蛋白酶的活性而進行侵襲，目前尚無關(guān)于CCR4與腫瘤侵襲能力相互關(guān)系方面的研究。在本研究中，我們選取胃癌臨床標本、采用胃癌細胞系及建立細胞共培養(yǎng)體系，分別通過IHC（免疫組化）、IHF（免疫組織熒光）、基因轉(zhuǎn)染、實時定量RT-PCR、FCM（流式細胞術(shù)）、懸浮芯片、侵襲實驗的方法，從明確CCR4在胃癌細胞中表達

4、的調(diào)節(jié)因素及分析其參與腫瘤免疫調(diào)節(jié)、腫瘤侵襲作用的新視角，揭示CCR4在胃癌中表達的調(diào)控機制及相關(guān)生物學(xué)功能，為闡釋趨化因子受體相關(guān)的腫瘤進展機制及尋找胃癌臨床治療新靶點提供重要數(shù)據(jù)和理論依據(jù)。
　　 第一部分CCR4在胃癌中的表達及調(diào)節(jié)機制
　　 目的:
　　 分別檢測CCR4在胃不典型增生組織、胃癌和配對的癌旁組織、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶及胃癌細胞系中的表達，分析CCR4的表達分布特點及其在胃癌中的表達調(diào)節(jié)因素和調(diào)控機

5、制。
　　 方法:
　　 1.選用石蠟包埋的臨床組織標本，包括胃不典型增生組織56例，胃癌和相應(yīng)癌旁組織各63例，及配對的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移胃癌42例，通過IHC檢測分析CCR4的表達分布特點及其與臨床病理參數(shù)的相關(guān)性;同時檢測胃癌組織中TNF-α的表達，分析CCR4與TNF-α在胃癌中表達的相關(guān)性。
　　 2.采用實時定量RT-PCR、FCM檢測CCR4在胃癌細胞系MKN-28（高分化）、SGC-7901（中分化）、A

6、GS（中分化）、MKN-45（低分化）中的表達。
　　 3.通過采用不同細胞因子（MCP-1、OPN、CCL22、TNF-α）刺激的方法，觀察CCR4表達的調(diào)控因素;及通過加信號通路抑制劑的方式研究CCR4表達的調(diào)控機制。
　　 結(jié)果:
　　 1.IHC結(jié)果顯示，CCR4在胃癌組織中的陽性率(27/63;42.9％)顯著高于癌旁(0/63;0)及胃不典型增生組織(2/56;3.6％)（P均＜0.001）;腫瘤原發(fā)

7、部位組織中CCR4的陽性率(15/42;35.7％)顯著低于淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶(35/42;83.3％)（P＜0.01）;胃癌組織中CCR4的表達與TNF-α成正比(P＜0.05)。
　　 2.實時定量RT-PCR檢測結(jié)果顯示，四種胃癌細胞系間CCR4mRNA的表達無顯著差異（P均＞0.05）;流式細胞術(shù)結(jié)果顯示，胃癌細胞系中CCR4蛋白均處于低表達狀態(tài)，無統(tǒng)計學(xué)差異（P均＞0.05）。
　　 3.細胞因子刺激實驗顯示，TNF

8、-α可通過NF-κB信號途徑以劑量依賴方式上調(diào)胃癌細胞中CCR4的表達。
　　 結(jié)論:
　　 1.CCR4在癌旁胃正常粘膜中不表達，在胃不典型增生組織中開始出現(xiàn)弱陽性，在胃癌組織中呈現(xiàn)高表達，在胃癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶中出現(xiàn)更高的陽性表達率，可見隨著胃腫瘤的發(fā)生及惡性演進，CCR4的表達出現(xiàn)逐漸增高的趨勢。
　　 2.CCR4在胃癌細胞中的表達和分化程度無關(guān)，胃癌細胞本身不能組成性高表達CCR4，而是由腫瘤微環(huán)境中的某些

9、因素（如TNF-α炎癥刺激）所誘導(dǎo)表達，并受到NF-κB信號通路的調(diào)控作用。
　　 3.以往研究報道CCR4在胃癌中表達，本研究則通過對比分析不同來源的胃組織標本中CCR4的表達分布特征，及采用細胞系的細胞因子刺激實驗，進一步明確了CCR4在胃癌細胞中的表達特點及其表達的相關(guān)調(diào)控機制，國內(nèi)外均未見報道。
　　 第二部分胃癌細胞異常表達CCR4在腫瘤免疫中的調(diào)節(jié)作用
　　 目的:
　　 分析淋巴細胞豐富的胃

10、癌及常見胃癌兩組間CCR4表達的差異，并通過建立體外共培養(yǎng)體系，觀察胃癌細胞高表達CCR4對腫瘤免疫的調(diào)節(jié)作用。
　　 方法:
　　 1.通過IHC分析CCR4在淋巴細胞豐富的胃癌和常見胃癌兩組間的差異表達;
　　 2.應(yīng)用SGC-7901胃癌細胞系，通過體外脂質(zhì)體瞬時轉(zhuǎn)染的方法使其過表達帶EGFP的CCR4，通過實時定量RT-PCR、熒光顯微鏡觀察及FCM分別檢測轉(zhuǎn)染效率，獲得高表達CCR4的胃癌細胞模型，并與

11、通過Ficoll分離獲得的人外周血單個核細胞(PBMC)建立共培養(yǎng)體系;
　　 3.采用FCM及懸浮芯片分別觀察SGC-7901細胞系過表達CCR4后對共培養(yǎng)體系中細胞因子及GrA（顆粒酶A）、GrB、穿孔素產(chǎn)生的影響。
　　 結(jié)果:
　　 1.IHC結(jié)果顯示，CCR4在淋巴細胞豐富的胃癌中的表達陽性率顯著高于常見胃癌（P＜0.05），并伴有與Th2型免疫反應(yīng)有關(guān)的生發(fā)中心形成現(xiàn)象發(fā)生;
　　 2.實時定

12、量RT-PCR、熒光顯微鏡觀察及FCM均證實獲得瞬時高表達CCR4的細胞模型。所建立的共培養(yǎng)體系中，PBMC+CCR4組IFN-γ的分泌水平較PBMC+MOCK對照組(P＜0.01)及PBMC+CCR4+復(fù)合物39組(P＜0.05)顯著降低，而IL-10的分泌水平較其他兩組顯著升高（P均＜0.01）;同時，PBMC+CCR4組的CD56+NK表達GrzA的水平較PBMC+MOCK和PBMC+CCR4+復(fù)合物39兩組顯著降低(P均＜0.0

13、5)，而GrzB和穿孔素的水平未見組間差異。
　　 結(jié)論:
　　 1.胃癌細胞異常高表達CCR4可負向調(diào)控抗腫瘤免疫反應(yīng)，調(diào)節(jié)細胞因子的分泌向Th2型偏移，并抑制免疫細胞毒效應(yīng)分子的分泌。
　　 2.與以往報道的由CCR4趨化性間接引起的免疫抑制不同，本研究證實了CCR4自身所具有的腫瘤免疫調(diào)控功能，為CCR4作為胃癌潛在免疫治療靶點的可能性提供了重要數(shù)據(jù)支持。
　　 第三部分CCR4在pNO胃癌患者中的

14、表達及其在腫瘤侵襲中的作用
　　 目的:
　　 本研究旨在通過觀察CCR4在無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的胃癌患者(pNO)腫瘤組織中的表達特點，分析CCR4與腫瘤侵襲性的關(guān)系，并在細胞系中進行驗證及進一步闡釋CCR4介導(dǎo)的腫瘤侵襲機制。
　　 方法:
　　 1.選取pNO的胃癌病人70例，采用IHC及IHF方法檢測腫瘤標本中CCR4的表達，并進行臨床病理參數(shù)相關(guān)性分析;
　　 2.應(yīng)用SGC-7901、BGC-

15、823胃癌細胞系，通過體外脂質(zhì)體瞬時轉(zhuǎn)染MOCK對照質(zhì)?；駿GFP-CCR4質(zhì)粒載體，通過實時定量RT-PCR、熒光顯微鏡觀察及FCM分別檢測轉(zhuǎn)染效率;
　　 3.采用侵襲試驗，觀察SGC-7901細胞系過表達CCR4后對胃癌細胞侵襲能力的影響;
　　 4.分別通過實時定量RT-PCR及明膠酶譜實驗檢測胃癌細胞系過表達CCR4后對MMP9基因及蛋白水平表達的影響。
　　 結(jié)果:
　　 1.IHC及IHF顯

16、示，CCR4在pNO胃癌病人腫瘤組織中具有兩種表達模式，分化較好的胃癌細胞為胞膜和胞漿同時存在（M+C型）為主，分化較差的胃癌細胞表達模式以胞漿型（C型）為主，具有侵襲行為的腫瘤細胞CCR4表達模式表現(xiàn)為C型。CCR4的表達與pNO胃癌患者T分期呈正相關(guān)(P＜0.05);
　　 2.實時定量RT-PCR、熒光顯微鏡觀察及FCM均證實轉(zhuǎn)染效率較高。體外侵襲實驗表明，胃癌細胞系SGC-7901、BGC-823過表達CCR4后，在不依

17、賴外源性配體刺激的條件下侵襲能力較MOCK對照組顯著增加(P＜0.05);
　　 3.實時定量RT-PCR及明膠酶譜實驗分別顯示，在有無或外源性配體刺激條件下，與MOCK對照組相比，CCR4均能顯著上調(diào)SGC-7901和BGC-823細胞MMP9基因表達水平(P＜0.05)及明顯增加MMP9蛋白分泌。
　　 結(jié)論:
　　 1.pNO患者胃癌細胞的浸潤侵襲行為與CCR4的表達呈正相關(guān)，且表現(xiàn)為高侵襲性的胃癌細胞中C