趨化因子受體CCR7在乳腺癌淋巴管浸潤中的作用及相關機制研究.pdf

1、趨化因子受體CCR7為七次跨膜的G蛋白耦聯(lián)受體，是CC類趨化因子受體的成員之一，在淋巴細胞及樹突狀細胞的歸巢中起重要作用，并且與多種人類腫瘤的淋巴結轉移相關。最近的研究發(fā)現(xiàn)CCR7還是預測T1期乳腺癌淋巴結轉移有效的分子標志物，基于在淋巴管內皮細胞表達其配體CCL21，所以推測CCR7與其配體的相互作用可能在乳腺癌淋巴管浸潤中起重要作用，結合近年來對腫瘤干細胞的研究基礎，分析乳腺癌早期淋巴道的轉移還可能與腫瘤干細胞的遷移有關。

2、本研究的主要目的是探討CCR7在乳腺癌淋巴管浸潤中的作用及其可能機制，主要從以下三個方面進行：(1)采用免疫組化方法標記102例乳腺癌及20例正常組織中微淋巴管，分析乳腺癌微淋巴管的特點及與淋巴管浸潤的關系。并進一步研究CCR7在乳腺癌組織中的表達與淋巴管浸潤及臨床病理參數(shù)之間的關系；(2)觀察人乳腺癌MCF-7細胞系的生長形態(tài)及分子標志物表達的差異，參照Ponti等的方法并進行適當改良，采用單細胞克隆加干細胞培養(yǎng)基篩選獲得乳腺癌干細胞

3、，探討CCR7在乳腺癌干細胞中的表達及其功能活性；(3)通過RNAi技術下調CCR7基因及蛋白的表達，研究對乳腺癌MCF-7細胞中腫瘤干細胞的增殖及體外遷移的影響。主要結果及結論如下： 1.乳腺癌組織中淋巴管與正常乳腺組織內的淋巴管相比具有明顯的異質性。表現(xiàn)為：①數(shù)目的差異：乳腺癌組織中淋巴管數(shù)目多，MLD均值為8.31±5.09，較正常乳腺組織內淋巴管(4.784±1.90)明顯增高(P＜0.01)；②形態(tài)的差異：乳腺癌組織內

4、的淋巴管管腔大且不規(guī)則，多呈擴張狀，存在淋巴管管壁的開放，并可觀察到癌細胞團從開放的淋巴管處進入淋巴管內的現(xiàn)象，也有的淋巴管受壓呈裂隙樣改變。乳腺癌組織中MLD與患者的年齡、腫瘤大小、腫瘤的病理類型、雌孕激素受體的表達及淋巴結的轉移無關。而淋巴管浸潤(Lymphaticvesselinvasion，LVI)與乳腺癌淋巴結的轉移顯著相關(p＜0.01)。說明LVI可能是乳腺癌淋巴結轉移有效的預測指標。 2.CCR7主要表達于乳腺癌

5、細胞的胞質與胞膜，少數(shù)可見胞核著色，在乳腺癌中陽性表達率為60.8％。CCR7的表達與病人的年齡，腫瘤大小、雌孕激素受體的表達、病理類型無關，而與乳腺癌淋巴管的浸潤及淋巴結的轉移相關(P＜0.01)，提示CCR7可能在介導癌細胞的淋巴管浸潤中起重要作用； 3.通過CD44/CD24雙標免疫熒光染色可見在常規(guī)培養(yǎng)的：MCF-7細胞中確實存在不同的腫瘤細胞亞群，主要為CD44+CD24+、CD44+CD24-及CD44-CD24+細

6、胞等，其中CD44+CD24-/Low細胞的比例為12.1％，進一步采用單細胞克隆培養(yǎng)也證實MCF-7細胞也存在生長形態(tài)學的差異，有周邊規(guī)則細胞間連接緊密類圓形的全克隆(holoclone)，有的克隆呈分散生長，形狀不規(guī)則(亞克隆，paraclone)，及其形狀處于兩者之間的部分克隆(又稱間生態(tài)克隆，meraclone)等，且發(fā)現(xiàn)在全克隆中富含CD44+CD24-/Low細胞，并通過克隆柱法獲得來自全克隆的MCF-7細胞的亞系(MCF-

7、7H)； 4.將MCF-7H細胞低密度接種加干細胞培養(yǎng)基懸浮培養(yǎng)篩選擴增可得到呈球樣生長的乳腺癌干細胞(MCF-7stemcells，MCF-7Scells)。細胞球球體規(guī)則，折光性好，周邊可見明顯生長暈。在形成的細胞球中富含CD44+CD24-/Low細胞，并且MCF-7S細胞在誘導分化時可見明顯類管腔樣結構形成，表達腺上皮細胞標記物CK18及肌上皮細胞標記物CK14； 5.免疫熒光染色發(fā)現(xiàn)CCR7也在乳腺癌干細胞球中

8、表達，CCR7表達主要位于細胞的胞質與胞膜。在其配體CCL21刺激后可引起乳腺癌干細胞內鈣流增加及肌動蛋白微絲的聚合，說明CCR7在乳腺癌干細胞中表達具有功能活性； 6.通過RNA干擾技術可下調乳腺癌干細胞中CCR7基因及蛋白的表達。CCR7表達的下調并不影響MCF-7S細胞的增殖活性，但可抑制其配體CCL21誘導的細胞的趨化遷移運動，提示CCR7與其配體的相互作用可能在介導乳腺癌干細胞的淋巴管浸潤及進一步淋巴結的轉移中起重要作