P300-CBP相關(guān)因子在腸型胃癌中的表達(dá)及功能研究.pdf

1、P300/CBP相關(guān)因子(P300/CBP associated factor，PCAF)是哺乳動(dòng)物中第一個(gè)被報(bào)道的組蛋白乙?；D(zhuǎn)移酶，目前研究認(rèn)為PCAF通過調(diào)節(jié)組蛋白和非組蛋白水平而與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展相關(guān)聯(lián)。PCAF的發(fā)現(xiàn)為GNAT家族，即GCNS相關(guān)的N端乙?；D(zhuǎn)移酶(GCNS-relatad-acetytransferas，GNAT)，在細(xì)胞中的正確定位提供了良好的解釋，為腫瘤的分子機(jī)理研究和預(yù)后判斷提供了新的思路，有望作為腫瘤

2、預(yù)后判斷的一個(gè)新的標(biāo)志物。PCAF基因在腫瘤中的研究目前尚是一個(gè)新的領(lǐng)域，迄今為止國(guó)內(nèi)外尚無有關(guān)于胃癌中PCAF的實(shí)驗(yàn)研究報(bào)道。鑒于以上原因，本實(shí)驗(yàn)擬研究PCAF基因在腸型胃癌中的表達(dá)情況，通過胃腺癌細(xì)胞株SGC-7901構(gòu)建能夠穩(wěn)定表達(dá)外源基因PCAF的胃癌細(xì)胞系，在此基礎(chǔ)上，觀察PCAF基因轉(zhuǎn)染對(duì)胃癌細(xì)胞體內(nèi)體外生長(zhǎng)的抑制作用并探討其可能機(jī)理，為胃癌的診斷和治療提供新的思路和理論依據(jù)。
　　 第一部分PCAF在人腸型胃癌組織

3、和胃腺癌細(xì)胞系中的表達(dá)
　　 目的：研究PCAF在人腸型胃癌組織和胃腺癌細(xì)胞系中的表達(dá)情況及其與臨床病理的相關(guān)性，以初步探討PCAF在人胃癌中表達(dá)的生物學(xué)意義。
　　 方法：采用Western blot方法檢測(cè)永生化人胃粘膜上皮細(xì)胞株GES-1和人胃癌細(xì)胞株SGC-7901，MKN-45，AGS中PCAF的表達(dá)。在406例臨床病理資料完整的腸型胃癌及對(duì)應(yīng)癌旁正常胃組織標(biāo)本中，采用免疫組織化學(xué)染色法檢測(cè)PCAF在組織學(xué)水平

4、的表達(dá)，結(jié)合臨床病理資料對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果統(tǒng)計(jì)分析。
　　 結(jié)果：
　　 1.Western-blot檢測(cè)提示胃腺癌細(xì)胞株中PCAF蛋白呈低至痕量表達(dá)，而永生化胃粘膜上皮細(xì)胞株GES-1中PCAF為高表達(dá)；
　　 2.在腸型胃癌組織中，PCAF的表達(dá)與胃壁侵犯、腫瘤瘤體大小、TNM分期、p21、pRb(P＜0.001)，PCNA相關(guān)(P＜0.01)；
　　 3.PCAF在腸型胃癌組織中的表達(dá)下調(diào)與突變型p53密切

5、相關(guān)(P＜0.01)；
　　 4.單因素分析顯示PCAF/wt p53的患者較其他組合類型的患者有更好的臨床預(yù)后(P＜0.0001)；
　　 5.多因素分析顯示，腫瘤的部位，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，PCAF/p53表型，＜0.0001)，胃壁侵犯(P=0.001)和PCNA(P=0.018)是判斷腸型胃癌預(yù)后的獨(dú)立預(yù)后因子。
　　 結(jié)論：PCAF特異性下調(diào)表達(dá)于腸型胃癌組織，可能引起胃癌腫瘤細(xì)胞中全組蛋白水平的下調(diào)和下游基因

6、的轉(zhuǎn)錄失活并可能通過影響腫瘤相關(guān)的非組蛋白，參與胃癌發(fā)生演進(jìn)的過程。PCAF與突變型p53的聯(lián)合檢測(cè)有助于在臨床判斷腸型胃癌患者的預(yù)后。
　　 第二部分pcDNA3.1-PCAF重組載體的構(gòu)建及轉(zhuǎn)染細(xì)胞的生物學(xué)效應(yīng)
　　 目的：應(yīng)用定向基因克隆技術(shù)，構(gòu)建PCAF基因真核表達(dá)載體pcDNA3.1-PCAF，建立并鑒定能穩(wěn)定表達(dá)外源PCAF基因的胃癌細(xì)胞系以研究PCAF基因?qū)GC-7901細(xì)胞生物學(xué)行為的影響及其可能的機(jī)理

7、。
　　 方法：
　　 1.(1)從美國(guó)ATCC哺乳動(dòng)物基因組獲得PCAF克隆(克隆號(hào)10435572)；
　　 (2)通過對(duì)pBluescriptR酶切分離獲得PCAF的cDNA插入全長(zhǎng)，并通過定向克隆技術(shù)構(gòu)建PCAF基因真核表達(dá)載體pcDNA3.1-PCAF；
　　 (3)對(duì)重組體pcDNA3.1-PCAF進(jìn)行鑒定；
　　 (4)測(cè)序結(jié)果重組體所含DNA序列與Genebank公布PCAF序列號(hào)

8、比對(duì)，結(jié)果一致。
　　 2.將PCAF基因的真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1-PCAF和空載體pcDNA3.1質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)化細(xì)菌、擴(kuò)增提取純化后，應(yīng)用脂質(zhì)體Lipo2000介導(dǎo)的方法分別轉(zhuǎn)染體外培養(yǎng)的p53突變型胃腺癌細(xì)胞系SGC-7901。G418篩選陽性克隆并擴(kuò)增培養(yǎng)傳代。鑒定穩(wěn)轉(zhuǎn)基因，并同時(shí)檢測(cè)其下游效應(yīng)分子p21、pRb等的表達(dá)。
　　 3.以成功構(gòu)建的分別能穩(wěn)定表達(dá)外源pcDNA3.1-PCAF、空載體pcDNA3.

9、1的胃癌細(xì)胞系和未轉(zhuǎn)染質(zhì)粒載體的SGC-7901細(xì)胞為研究對(duì)象，通過MTT比色、軟瓊脂克隆集落形成等一系列細(xì)胞學(xué)功能實(shí)驗(yàn)及TUNEL染色的形態(tài)學(xué)觀察，探索穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株中PCAF的表達(dá)對(duì)腫瘤細(xì)胞增殖、凋亡的影響。
　　 結(jié)果：
　　 1.(1)應(yīng)用脂質(zhì)體將質(zhì)粒pcDNA3.1順利導(dǎo)入大腸桿菌DH5α內(nèi)，且轉(zhuǎn)化效率高。
　　 (2)酶切電泳結(jié)果顯示pcDNA3.1質(zhì)粒被EcoRI、Acc65I成功雙酶切。
　

10、　 (3)RT-PCR方法擴(kuò)增的插入片段電泳證實(shí)擴(kuò)增的片段即為目的片段。重組質(zhì)粒酶切鑒定預(yù)期目的條帶。
　　 (4)測(cè)序結(jié)果重組體所含DNA序列與Genebank公布PCAF序列比對(duì)，結(jié)果一致。
　　 2.重組體pcDNA3.1-PCAF轉(zhuǎn)染細(xì)胞株和空載體pcDNA3.1轉(zhuǎn)染細(xì)胞株均獲得氨芐青霉素抗性。重組體pcDNA3..1-PCAF轉(zhuǎn)染細(xì)胞株和空載體pcDNA3.1轉(zhuǎn)染細(xì)胞株因攜帶有Neor擴(kuò)標(biāo)簽，均檢測(cè)到Neor

11、的表達(dá)，證實(shí)轉(zhuǎn)染成功。Westernblot顯示重組體pcDNA3.1-PCAF轉(zhuǎn)染細(xì)胞株中目的基因PCAF在蛋白質(zhì)水平上表達(dá)均較空載體轉(zhuǎn)染細(xì)胞株和未轉(zhuǎn)染細(xì)胞株顯著增強(qiáng)。
　　 3.對(duì)轉(zhuǎn)染前后的細(xì)胞觀察表明，重組體轉(zhuǎn)染組細(xì)胞生長(zhǎng)減慢，克隆形成率降低，裸鼠體內(nèi)成瘤受到抑制，但凋亡變化不明顯。
　　 結(jié)論：
　　 1.應(yīng)用基因克隆技術(shù)成功構(gòu)建PCAF基因真核表達(dá)載體pcDNA3.1-PCAF。
　　 2.成功