miRNA-181a在胃癌中的表達(dá)及功能研究.pdf

1、研究背景：
　　微小 RNA(microRNAs，miRNAs)是近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的一類(lèi)長(zhǎng)約21-25個(gè)核苷酸的內(nèi)源性單鏈非編碼 RNA，在動(dòng)物及植物中均有表達(dá)。miRNAs通常在轉(zhuǎn)錄后水平抑制靶基因的表達(dá)。miRNA與靶基因結(jié)合的關(guān)鍵部位稱(chēng)為“種子區(qū)域”(seed region，miRNA5?末端開(kāi)始2-7個(gè)核苷酸)，與miRNA3?UTR通過(guò)堿基配對(duì)結(jié)合。miRNAs調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、凋亡、分化以及遷移等重要的生物學(xué)過(guò)程。miRNAs表

2、達(dá)和代謝的異常還與多種疾病如腫瘤密切相關(guān)。一些miRNAs在腫瘤組織中表達(dá)異常，促進(jìn)了腫瘤的發(fā)生和進(jìn)展，其作用相當(dāng)于致癌基因或抑癌基因。目前已有證據(jù)提示miRNAs可應(yīng)用于腫瘤的基因診斷和治療。
　　中國(guó)是胃癌高發(fā)的國(guó)家，據(jù)世界權(quán)威專(zhuān)家估計(jì)，全世界每年新發(fā)現(xiàn)的胃癌患者約為75.5萬(wàn)例，其中大約35％來(lái)自中國(guó)。我國(guó)胃癌發(fā)病率和死亡率在世界上都處于較高水平。雖然目前采取了包括手術(shù)、化療以及其它綜合性治療措施，但胃癌的治療效果仍不是十分

3、理想，五年生存率低下。這是由于我們對(duì)于胃癌的發(fā)病機(jī)理尚缺乏更全面和深入的了解，臨床上也缺乏特異性的胃癌腫瘤標(biāo)記物，因此，深入研究胃癌的發(fā)生發(fā)展機(jī)制，尋找新的生物標(biāo)記物和治療靶標(biāo)，提高胃癌的早期診斷率和臨床預(yù)后都是擺在醫(yī)學(xué)工作者面前的必須攻克的難題。
　　我們前期工作已應(yīng)用miRNA基因芯片(Illumina公司)，并通過(guò)應(yīng)用熒光定量RT-PCR技術(shù)證實(shí)miR-181a在胃癌中為高表達(dá)。
　　目的：
　　本實(shí)驗(yàn)將在前期實(shí)

4、驗(yàn)的基礎(chǔ)上，研究miRNA-181a（miR-181a）在胃癌細(xì)胞系中的表達(dá)和功能，并且探索其可能的分子機(jī)制。
　　方法：
　　用qRT-PCR分析miR-181a在胃癌細(xì)胞SGC-7901、MGC-803、BGC-823表達(dá)情況，結(jié)合細(xì)胞的增殖和分化特征，篩選合適的胃癌細(xì)胞株進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)；構(gòu)建質(zhì)粒miR-181a Inhibitor，使用miR-181a Inhibitor和陰性對(duì)照（質(zhì)粒NC）轉(zhuǎn)染胃癌 SGC-7901

5、細(xì)胞，通過(guò)相差顯微鏡觀察以及 MTS、流式細(xì)胞儀(FACS)、Transwell細(xì)胞遷移和細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)等技術(shù)和方法分析miR-181a對(duì)胃癌細(xì)胞的細(xì)胞周期、增殖與凋亡、遷移與侵襲等生物學(xué)行為的影響；應(yīng)用miRanda、Pictar和targetscan等生物信息學(xué)方法對(duì)miR-181a靶基因進(jìn)行預(yù)測(cè)，雙螢光素酶報(bào)告系統(tǒng)驗(yàn)證miR-181a的靶基因(ATM和KLF6)的；Western Blot檢測(cè)胃癌細(xì)胞中ATM和KLF6蛋白的變化；選

6、取9例胃癌患者標(biāo)本研究胃癌和非癌組織表達(dá)的miR-181a和靶基因表達(dá)的相關(guān)性。
　　結(jié)果：
　　1．miR-181a在胃癌組織和胃癌細(xì)胞中表達(dá)升高，miR-181a的高表達(dá)和胃癌患者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及年齡相關(guān)，與性別及腫瘤分化程度無(wú)關(guān)。在本實(shí)驗(yàn)的60例胃癌中，有52例(86.67%)miR-181a表達(dá)升高，升高倍數(shù)平均值為5.45。
　　2．以三個(gè)胃非癌組織中 miR-181a的表達(dá)量平均值為對(duì)照，miR-181a在SG

7、C-7901、MGC-803、BGC-823胃癌細(xì)胞株中明顯高表達(dá)，增高的倍數(shù)分別是26.68、14.83、14.96倍；miR-181a在胃癌SGC-7901細(xì)胞中表達(dá)最高，我們選擇該細(xì)胞系進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。
　　3．外源性沉默表達(dá)miR-181a能顯著抑制胃癌SGC-7901細(xì)胞的增殖、遷移、侵襲以及克隆形成，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。
　　4．miR-181a直接和負(fù)性調(diào)控抑癌基因ATM和KLF6的表達(dá)。使用生物信息學(xué)方法分析，預(yù)測(cè)出

8、ATM和KLF6是miR-181a的靶基因。雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)證實(shí)ATM和KLF6是miR-181a的下游靶點(diǎn)；Western Blots進(jìn)一步證實(shí)轉(zhuǎn)染miR-181a inhibitor后，靶蛋白表達(dá)出現(xiàn)明顯差異。推斷miR-181a發(fā)揮抑制靶蛋白ATM和KLF6的表達(dá)作用是通過(guò)直接與靶基因3?-非翻譯區(qū)結(jié)合。
　　5．應(yīng)用RT-PCR及Westen Blot檢測(cè)9對(duì)胃癌病人的miR-181a與ATM和KLF6的表達(dá)水平，并發(fā)現(xiàn)

9、相對(duì)于非癌正常組織，絕大多數(shù)胃癌組織中的miR-181a為高表達(dá)，而且其靶基因ATM和KLF6在絕大多數(shù)標(biāo)本中為低表達(dá)，差別具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)；分析ATM和KLF6的蛋白水平和miR-181a的表達(dá)水平存在明顯的負(fù)相關(guān)性，相關(guān)系數(shù)為；ATM：-0.539，P=0.021＜0.05；KLF6：-0.590，P=0.010＜0.05。
　　結(jié)論：
　　1．miR-181a在胃癌組織和胃癌細(xì)胞中高表達(dá)，miR-181a

10、高表達(dá)和胃癌患者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及年齡相關(guān)，與性別及腫瘤分化程度無(wú)關(guān)。
　　2．miR-181a在胃癌發(fā)病是致癌性miRNA。抑制miR-181a表達(dá)，可以明顯抑制胃癌 SGC-7901細(xì)胞功能，諸如增殖，生長(zhǎng)，遷移，侵襲，克隆形成，促進(jìn)凋亡；提示miR-181a表達(dá)水平可能參與細(xì)胞功能的分子調(diào)控，有可能成為胃癌治療的分子靶點(diǎn)。
　　3．在胃癌組織中miR-181a和抑癌基因ATM和KLF6蛋白的表達(dá)水平呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)性。miR-18