REC8在EB病毒相關(guān)胃癌中的表達(dá)及潛在功能研究.pdf

1、研究背景：
　　胃癌是全球最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，胃癌的病因主要有遺傳因素、不良生活與飲食習(xí)慣及幽門螺桿菌(Helicobacterpylori，H.pylori)感染等因素。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)約有10％的胃癌組織中可檢測(cè)到EB病毒（Epstein-Barrvirus，EBV），這類胃癌被稱為EB病毒相關(guān)胃癌（Epstein-BarrVirus-associatedgastriccarcinoma，EBVaGC）。EBV屬DNA皰疹病毒

2、，可通過(guò)與B淋巴細(xì)胞表面的受體分子CD21結(jié)合，使受感染的B淋巴細(xì)胞永生化，從而參與Burkitt淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤等惡性腫瘤的發(fā)生。但胃癌上皮細(xì)胞表面缺乏CD21分子的表達(dá)，因此，EBV參與EBVaGC發(fā)生發(fā)展的機(jī)制仍需進(jìn)一步研究。
　　目前越來(lái)越多的證據(jù)表明EBVaGC發(fā)生可能與DNA異常甲基化相關(guān)。DNA甲基化是一種重要的表觀遺傳學(xué)機(jī)制，抑癌基因發(fā)生高甲基化后出現(xiàn)表達(dá)下調(diào)或失活從而導(dǎo)致腫瘤發(fā)生發(fā)展。研究發(fā)現(xiàn)EBVaGC組織

3、中存在多種腫瘤相關(guān)基因高甲基化，如GSTP1、MGMT、RASSF1A、PTEN、GSTP1、P73等在EBVaGC的甲基化頻率顯著高于EBV陰性胃癌，因此推測(cè)EBV感染誘導(dǎo)宿主基因發(fā)生甲基化從而促進(jìn)腫瘤發(fā)生。前期研究發(fā)現(xiàn)REC8在EBV感染的胃癌細(xì)胞株中表達(dá)下調(diào)，且基因啟動(dòng)子區(qū)表現(xiàn)為高甲基化，因此推斷EBV誘導(dǎo)宿主REC8發(fā)生高甲基化使其表達(dá)下調(diào)從而參與EBVaGC的發(fā)生發(fā)展。
　　REC8位于染色體14q12，是減數(shù)分裂重組蛋

4、白，在姐妹染色單體和同源染色體的分離過(guò)程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。研究發(fā)現(xiàn)在惡性胃腸道間質(zhì)瘤（GastrointestinalStromalTumors，GIST）中，REC8發(fā)生甲基化，且有REC8甲基化的患者預(yù)后較差。但REC8在EBVaGC中的功能與作用機(jī)制尚未見(jiàn)報(bào)道，REC8在EBVaGC中的表達(dá)及REC8的生物學(xué)功能有待進(jìn)一步研究。
　　研究目的：
　　本實(shí)驗(yàn)擬研究REC8在EBVaGC中的表達(dá)及其與EBV感染的關(guān)系，并初步

5、探索REC8的生物學(xué)功能以揭示其抑癌作用的機(jī)制。
　　研究方法：
　　1、收集胃癌組織標(biāo)本，首先以EBER原位雜交法檢測(cè)其EBV感染率，并根據(jù)EBV感染強(qiáng)弱將其分為EBV陰性組（EBVnGC）、弱陽(yáng)性組（loEBVaGC）及強(qiáng)陽(yáng)性組（hiEBVaGC），免疫組化法半定量檢測(cè)REC8蛋白表達(dá)水平，探索EBV感染與REC8表達(dá)之間的關(guān)系。
　　2、提取胃癌組織DNA，亞硫酸鹽修飾后進(jìn)行甲基化測(cè)序，探究EBV感染與REC8甲

6、基化水平的關(guān)系，從而揭示REC8啟動(dòng)子區(qū)的甲基化水平與EBV感染的相關(guān)性。
　　3、培養(yǎng)胃癌細(xì)胞BGC823、MGC803，分別轉(zhuǎn)染REC8質(zhì)粒及pcDNA3.1對(duì)照質(zhì)粒，從mRNA及蛋白水平驗(yàn)證其過(guò)表達(dá)效果，通過(guò)MTT實(shí)驗(yàn)、細(xì)胞周期及細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)探索REC8生物學(xué)功能，闡述REC8在EBVaGC抑癌作用的機(jī)制。
　　結(jié)果：
　　1、154份胃癌標(biāo)本中有17份EBV檢測(cè)陽(yáng)性，EBV感染率為11%，其中EBV強(qiáng)陽(yáng)性組有6

7、例，EBV弱陽(yáng)性組有11例。
　　2、免疫組化法發(fā)現(xiàn)陰性組、弱陽(yáng)性組、強(qiáng)陽(yáng)性組中REC8表達(dá)水平積分分別為9.25±0.75、6.55±1.155以及2.67±0.7149，三組間REC8表達(dá)水平差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=12.357，P=0.002）。
　　3、陰性組、弱陽(yáng)性組與強(qiáng)陽(yáng)性組甲基化水平分別為61.23±6.8698%，59.14±4.6468%與61.77±7.2734%，三組間甲基化水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=3

8、.061，P=0.06）。
　　4、轉(zhuǎn)染REC8質(zhì)粒后，BGC823、MGC803細(xì)胞的REC8mRNA表達(dá)水平與蛋白水平均顯著升高。
　　5、轉(zhuǎn)染72h后，BGC823/REC8細(xì)胞與對(duì)照組OD值（A490nm）分別為0.711±0.0806與1.331±0.1996，MGC803/REC8細(xì)胞與MGC803/pcDNA3.1的OD值（A490nm）分別為0.758±0.0914與1.266±0.0295，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意

9、義（P=0.006）。與對(duì)照組相比，轉(zhuǎn)染REC8質(zhì)粒對(duì)BGC823、MGC803細(xì)胞的增殖抑制率分別為46.557±6.0569%與40.153±7.2156%，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。
　　6、BGC823/REC8細(xì)胞的G0/G1期比例較對(duì)照組相對(duì)增加（60.97±0.7454%vs47.08±0.4034%，P<0.0001），MGC803/REC8細(xì)胞的G0/G1期比例為47.34±1.238%，與對(duì)照組相比增

10、高（40.23±1.419%），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），表明REC8可調(diào)節(jié)細(xì)胞周期，使胃癌細(xì)胞阻滯在G0/G1期。
　　7、BGC823/REC8細(xì)胞的早期凋亡細(xì)胞數(shù)較對(duì)照組增加（7.707±0.4248%vs1.477±0.3719%，P=0.0004），MGC803/REC8早期凋亡細(xì)胞數(shù)量比對(duì)照組高（15.63±1.783%，7.980±1.210%，P<0.05），表明REC8具有促進(jìn)胃癌細(xì)胞早期凋亡的功能。<