白介素17及趨化因子受體CCR4、CCR6與類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的相關(guān)性研究.pdf

1、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(theumatoid artbritis，RA)是一種主要累及周圍關(guān)節(jié)為主的自身免疫性疾病?，F(xiàn)知RA由多種因素引發(fā)，T細(xì)胞在RA的發(fā)病和進(jìn)展中起關(guān)鍵性作用，近年的研究發(fā)現(xiàn)，類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎與機(jī)體的免疫功能紊亂密切相關(guān)，多種復(fù)雜的細(xì)胞因子參與了類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者關(guān)節(jié)的破壞和全身紊亂過(guò)程。TNF-α和IL-1的抑制物干擾性治療在RA中取得了良好的療效，這充分支持了細(xì)胞因子在RA中發(fā)揮著重要作用的觀點(diǎn)。IL-17是由新近被證實(shí)的

2、一類不同于Th1和Th2細(xì)胞亞群的CD4+輔助性T細(xì)胞亞型--Th17細(xì)胞(此亞群細(xì)胞可產(chǎn)生IL-17、IL-6和TNF-α而不產(chǎn)生IFN-γ和IL-4)產(chǎn)生的促炎性細(xì)胞因子，表達(dá)在T細(xì)胞上，其受體(IL-17R)表達(dá)在大多數(shù)細(xì)胞和組織上。IL-17是一個(gè)促炎癥反應(yīng)的調(diào)節(jié)因子，對(duì)靶細(xì)胞可以產(chǎn)生炎癥誘導(dǎo)作用。IL-17在調(diào)節(jié)免疫和炎癥應(yīng)答，調(diào)節(jié)一些組織內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定和自身免疫疾病的進(jìn)展中發(fā)揮重要作用。IL-17作為T細(xì)胞誘導(dǎo)炎癥的一個(gè)重要的

3、活化劑，與TNF-α和IL-1β又有一些共同的生物學(xué)特性，IL-17可以抑制RA滑膜和骨Ⅰ型膠原的合成，刺激它的分解，因此在RA發(fā)病機(jī)理中可能起到作用。目前對(duì)IL-17在RA發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮作用的研究仍不是很完善。最新的研究顯示，在正常人的外周血和患者的炎癥組織中，記憶/效應(yīng)性Th17細(xì)胞出現(xiàn)在CCR6+亞群當(dāng)中，CCR6+CCR4+T細(xì)胞可以特異性產(chǎn)生大量的IL-17，而不產(chǎn)生IFN-γ，同時(shí)這些細(xì)胞還表達(dá)對(duì)Th17發(fā)育起關(guān)鍵作用的轉(zhuǎn)錄

4、因子--孤獨(dú)受體(RORrt)。目前CCR4和CCR6是否可以作為Th17細(xì)胞表面的特征性標(biāo)志，還有待進(jìn)一步研究。本實(shí)驗(yàn)擬研究中國(guó)RA活動(dòng)期患者、RA穩(wěn)定期患者、系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者和健康人血清中IFN-γ、IL-10、IL-17水平的差異，及外周血CD4+T細(xì)胞表面CCR4和CCR6表達(dá)水平的差異，以明確IL-17、CCR4、CCR6與RA疾病的相關(guān)性以及IL-17與CCR4和CCR6的相關(guān)性，探討Th17細(xì)胞在RA中的作用地位，為尋找

5、以細(xì)胞因子為靶點(diǎn)應(yīng)用于RA臨床治療的新策略提供科學(xué)依據(jù)。 實(shí)驗(yàn)材料 1、研究對(duì)象 選擇本院門診及住院RA患者65例，入選標(biāo)準(zhǔn)：符合1987年美國(guó)風(fēng)濕病協(xié)會(huì)修訂的RA診斷標(biāo)準(zhǔn)，并排除有嚴(yán)重心腦血管、肝腎疾病和其他自身免疫性疾病，年齡18-60歲，平均41±13歲，其中男20例，女45例，活動(dòng)期35例，穩(wěn)定期30例作為病例組，判斷活動(dòng)期的標(biāo)準(zhǔn)為滿足以下5項(xiàng)指標(biāo)中的3項(xiàng)或3項(xiàng)以上者，包括：①3個(gè)或3個(gè)以上關(guān)節(jié)腫；②每日

6、＞45min的晨僵；③血沉≥28mm/h；④3個(gè)或3個(gè)以上關(guān)節(jié)壓痛；⑤雙手平均握力(每只手各測(cè)3次，將單手最高值相加除以2為所得值)，男性≦192mmHg，女性≦146mmHg；系統(tǒng)性紅斑狼瘡(systemiclupuserythematosus，SLE)患者35例，入選標(biāo)準(zhǔn)：符合1997年美國(guó)風(fēng)濕病協(xié)會(huì)修訂的SLE診斷標(biāo)準(zhǔn)，并排除有嚴(yán)重心腦血管、肝腎疾病和其他自身免疫性疾病，年齡18-60歲，平均39±13歲，其中男10例，女25例作

7、為病例對(duì)照組；健康對(duì)照組為本院健康體檢者50例，年齡18-60歲，平均38±12歲，其中男17例，女33例，血液系統(tǒng)及肝腎功能檢查正常，乙型肝炎表面抗原及抗丙型肝炎抗體陰性，無(wú)免疫系統(tǒng)疾病史。SLE組和健康組的年齡、性別與RA組均相匹配。 2、實(shí)驗(yàn)儀器及試劑購(gòu)自BECTONDICKINSON公司的主要實(shí)驗(yàn)設(shè)備及試劑，包括流式細(xì)胞儀(FACS-Aria)；10mlEDTA抗凝管；單克隆抗體：CD3-PerCP、CD4-FITC、C

8、CR6-PE、CCR4-PE-Cy7。IFN-γ、IL-10、IL-17的ELISA定量試劑盒購(gòu)自R&D公司。其余試劑自行配制：溶血素(KHCO3:1.0g，NH4CL:8.25g，EDTA·Na2:0.037g，Water:1000ml)。 實(shí)驗(yàn)方法 1、血清IFN-γ、IL-10、IL-17水平檢測(cè)采集血清標(biāo)本，使用R&D公司定量試劑盒(ELISA法)對(duì)血清IFN-γ、IL-10、IL-17水平進(jìn)行檢測(cè)，酶標(biāo)儀檢測(cè)4

9、50nm處讀OD值，以試劑盒提供的標(biāo)準(zhǔn)品繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算IFN-γ、IL-10、IL-17含量。 2、外周血CD4+T細(xì)胞表面CCR4和CCR6表達(dá)水平的檢測(cè)應(yīng)用以下PerCP、FITC、PE、PE-Cy7標(biāo)記單抗組合對(duì)RA患者、SLE患者和健康對(duì)照組全血進(jìn)行分析：CD3/CD4/CCR6/CCR4；另設(shè)1管對(duì)照。加入100μl抗凝血，按上述組合依次加入單抗，室溫避光30min。加入溶血素3ml，室溫，1200r/min離心5

10、min，棄上清，洗滌兩次。加入1％多聚甲醛的PBS200μl懸浮，BDFACDiVaTM軟件進(jìn)行檢測(cè)分析。 3、流式細(xì)胞儀分析及統(tǒng)計(jì)學(xué)分析使用前向散射角(FSC)及側(cè)向散射角(SSC)確定淋巴細(xì)胞群，以CD3+T淋巴細(xì)胞為門，再分別以CD4+T淋巴細(xì)胞為門，分析CCR4和CCR6的表達(dá)水平。選用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)學(xué)分析軟件。RA活動(dòng)期患者、RA穩(wěn)定期患者、SLE患者組和健康對(duì)照組血清IFN-γ、IL-10、IL-17的水平及C

11、CR4和CCR6的表達(dá)水平主要應(yīng)用單向方差分析進(jìn)行比較，IL-17與CCR4和CCR6的相關(guān)性采用Spearman秩相關(guān)檢驗(yàn)，P<0.05視為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 實(shí)驗(yàn)結(jié)果 1、RA患者、SLE患者和健康對(duì)照組血清中IFN-γ、IL-10、IL-17的表達(dá)水平: (1)血清中IFN-γ的表達(dá)水平 與健康對(duì)照組相比，RA活動(dòng)期和穩(wěn)定期患者血清中IFN-γ的表達(dá)水平均出現(xiàn)有意義的升高(P<0.05)；SLE患者血

12、清中的IFN-γ水平也明顯高于健康對(duì)照組(P<0.05)；RA活動(dòng)期和穩(wěn)定期與SLE組相比，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；RA活動(dòng)期與穩(wěn)定期相比，無(wú)顯著差異(P>0.05)。 (2)血清中IL-10的表達(dá)水平 與健康對(duì)照組相比，RA活動(dòng)期和穩(wěn)定期患者血清中IL-10的表達(dá)水平都稍有升高，但差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；SLE患者的IL-10水平顯著高于健康對(duì)照組(P<0.05)；RA活動(dòng)期和穩(wěn)定期與SLE組相

13、比，差異均具有顯著性(P<0.05)；RA活動(dòng)期與穩(wěn)定期相比，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。 (3)血清中IL-17的表達(dá)水平 RA活動(dòng)期患者血清中IL-17的表達(dá)水平與SLE患者和健康組相比，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；而RA穩(wěn)定期患者與SLE患者和健康組相比，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；SLE患者IL-17的表達(dá)水平與健康組相比，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；RA活動(dòng)期與穩(wěn)定期患者相比，差異顯

14、著(P<0.05)。 2、RA患者、SLE患者和健康對(duì)照組外周血CD4+T細(xì)胞表面CCR4和CCR6的表達(dá): (1)外周血CD4+T細(xì)胞表面CCR4的表達(dá)RA活動(dòng)期患者外周血CD4+T細(xì)胞表面CCR4的表達(dá)水平與健康組相比，差異具有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，而與SLE組相比，無(wú)顯著性差異(P>0.05)；RA穩(wěn)定期患者與SLE患者和健康組相比，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；SLE患者與健康組相比，CCR4的

15、表達(dá)水平升高明顯(P<0.05)；RA活動(dòng)期與穩(wěn)定期相比，差異顯著(P<0.05)。 (2)外周血CD4+T細(xì)胞表面CCR6的表達(dá) RA活動(dòng)期患者外周血CD4+T細(xì)胞表面CCR6的表達(dá)水平與SLE患者和健康組相比，差異均有明顯的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；RA穩(wěn)定期與健康組相比，差異顯著(P<0.05)，而與SLE組相比，無(wú)明顯差異(P>0.05)；SLE患者與健康組相比，CCR6的表達(dá)水平無(wú)明顯變化(P>0.05)；R

16、A活動(dòng)期與穩(wěn)定期相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。 (3)外周血CD4+T細(xì)胞表面CCR4+CCR6+T細(xì)胞的表達(dá) RA活動(dòng)期患者外周血CD4+T細(xì)胞表面CCR4+CCR6+T的表達(dá)水平與SLE組和健康組相比，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；RA穩(wěn)定期與SLE組和健康組相比，無(wú)顯著性差異(P>0.05)；SLE患者CCR4+CCR6+T的表達(dá)水平與健康組相比，差異無(wú)顯著性(P>O.05)；RA活動(dòng)期與穩(wěn)定期相

17、比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。 3、RA患者外周血中IL-17與CCR4和CCR6的相關(guān)性比較 RA活動(dòng)期和穩(wěn)定期患者血清中IL-17的水平與外周血CD4+T細(xì)胞CCR4表達(dá)的相關(guān)性比較，結(jié)果無(wú)明顯的相關(guān)性(P>0.05)，但與CCR6的表達(dá)和CD4+CCR4+CCR6+T的數(shù)量呈正相關(guān)(P<0.05)。 結(jié)論： 1、RA活動(dòng)期和穩(wěn)定期患者血清中IFN-γ的水平均出現(xiàn)有意義的升高，但I(xiàn)L-10的分