地衣芽胞桿菌木糖利用代謝工程.pdf

1、當前社會發(fā)展面臨的能源和糧食危機使得人類對開發(fā)利用纖維素生物質資源寄予厚望，在發(fā)酵工業(yè)中以木質纖維素或其降解物作為發(fā)酵原料降低發(fā)酵成本解決資源危機已成共識。木糖是木質纖維素中含量僅次于葡萄糖的單糖，但很多微生物代謝木糖能力不強，且在以葡萄糖和木糖等混合碳源發(fā)酵時，CCR效應會抑制木糖的攝入利用。本研究旨在以本實驗室保藏的地衣芽胞桿菌(Bacillus licheniformis)WX-02為出發(fā)菌株，構建能高效穩(wěn)定利用木糖的工程菌株。<

2、br>　　為解除該菌株的CCR效應使菌株能同時高效利用葡萄糖和木糖發(fā)酵，敲除基因ccpA得到缺失菌株WX-02△ccpA，考察在乙偶姻發(fā)酵培養(yǎng)基下缺失菌株與野生菌株的生長狀況及乙偶姻的產(chǎn)量，發(fā)現(xiàn)缺失菌株的生長嚴重受阻。已有報道表明細菌中受CRR效應調控的基因數(shù)量龐大，可能該基因缺失干擾了與菌株生長代謝極其重要的基因的表達，因此通過此方式解除CCR效應是不合適的。
　　進而考慮在野生菌株中敲除PTS系統(tǒng)中的ptsG和ptsH基因，得

3、到缺失菌株WX-02△ptsGH，使菌株不能產(chǎn)生CcpA的結合蛋白HPr，從而間接導致CcpA不能發(fā)揮作用。同樣在乙偶姻發(fā)酵培養(yǎng)基中考察該菌株的特性，缺失菌株生長不受影響，且在只有葡萄糖情況下不影響菌株對葡萄糖的攝入利用，乙偶姻、丁二醇的產(chǎn)量也無顯著性差異;進而在以60g/L葡糖糖和30g/L木糖為底物的乙偶姻發(fā)酵培養(yǎng)基中檢測上述指標，結果表明葡萄糖都能在16h時耗完，木糖消耗水平和乙偶姻、丁二醇產(chǎn)量都無顯著性差異。這兩方面數(shù)據(jù)顯示pt

4、sGH的缺失對CCR效應的解除未達到預期效果。
　　以上嘗試解除CCR效應的策略都未起到預期的效果，則試圖通過增強木糖特異性轉運實現(xiàn)預期目的，超表達B.subtilis來源的木糖轉運蛋白AraE，得到工程菌株WX-02pHYaraE，同樣在以60g/L葡糖糖和30g/L木糖為底物的乙偶姻發(fā)酵培養(yǎng)基中檢測上述指標，結果表明工程菌株的木糖利用水平并未增強。
　　據(jù)此情況，選擇增強木糖代謝途徑中的關鍵酶來作進一步探究，在WX-02

5、基礎上超表達其自身的木糖異構酶XylA，木酮糖激酶XylB，得到工程菌株WX-02pT49xylA，WX-02pT49xylB，在同上培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件下檢測菌株生長狀況及木糖消耗水平，發(fā)現(xiàn)木糖消耗水平并未得到提升，且因為轉入質粒載體的原因，工程菌株的生長狀況比野生型菌株稍弱。
　　另外，本研究還嘗試通過對xylAB操縱子的去調控，如敲除該操縱子阻遏蛋白XylR編碼基因xylR，以及用組成型啟動子P43替換木糖異構酶基因xylA的可