代謝工程會議

1、基于動態(tài)代謝組學分析與合成途徑動力學模型的代謝途徑診斷方法的構建與應用,2015年微生物代謝工程與發(fā)酵工程學術研討會—無錫,報告人：劉龍江南大學生物工程學院2015-11-11,報告提綱,一、研究背景二、系統(tǒng)代謝調(diào)控Bacillus subtilis合成N-乙酰氨糖(GlcNAc)三、穩(wěn)態(tài)代謝組學定量解析B. subtilis工程菌代謝特性四、基于GlcNAc合成途徑動力學模型的代謝瓶頸診斷與解除五、研究結論,1. 發(fā)酵工程

2、與代謝工程,發(fā)酵工程與代謝工程的重要意義:發(fā)酵工程利用可再生資源生產(chǎn)燃料、工業(yè)化合物及功能營養(yǎng)品，實現(xiàn)綠色經(jīng)濟與低碳經(jīng)濟，微生物菌種選育和構建是發(fā)酵工程的基礎和核心； 代謝工程已成為微生物菌種選育和構建的重要手段，是發(fā)酵工程領域的一個重要分支和研究熱點。,,1.1 代謝工程研究的一般思路與方法,微生物代謝工程研究的一般思路:1、基于文獻/數(shù)據(jù)庫分析的目標產(chǎn)物合成途徑理性設計； 2、代謝產(chǎn)物(目標產(chǎn)物、副產(chǎn)物)合成途徑的局部調(diào)控；

3、3、工程菌生產(chǎn)特性及代謝網(wǎng)絡的系統(tǒng)優(yōu)化與全局調(diào)控；4、動力學/組學分析確定代謝瓶頸，進行新一輪代謝改造。,1.2 代謝途徑理性設計的一般思路,代謝途徑理性設計的一般思路:1、文獻/數(shù)據(jù)庫/化合物庫分析尋找合適的目標產(chǎn)物合成途徑(酶) 2、在微生物宿主高效表達目標基因(微生物、動物、植物)3、若文獻/數(shù)據(jù)庫無合適的基因(酶)，需首先利用高通量篩選技術篩選獲 得目標微生物4、利用比較基因組學和轉錄組學確定目標產(chǎn)物合

4、成基因(簇)5、根據(jù)酶反應特點利用計算機軟件模擬并合成人工途徑酶,1.3 代謝途徑優(yōu)化與調(diào)控一般思路與方法,代謝途徑優(yōu)化與調(diào)控一般思路:表達方式優(yōu)化(游離、整合)啟動子工程終止子工程轉錄因子調(diào)控核糖體工程代謝途徑(酶)定向進化空間支架構建體外重構反應體系底物轉運/產(chǎn)物輸出強化,表達方式優(yōu)化,啟動子工程,終止子工程,轉錄因子調(diào)控,核糖體工程,代謝途徑(酶)進化,空間支架構建,體外重構反應體系,底物轉運/產(chǎn)物輸出途徑強化

5、,代謝網(wǎng)絡系統(tǒng)優(yōu)化與整體調(diào)控常用方法:全局轉錄機器工程模塊途徑工程全基因組規(guī)模代謝網(wǎng)絡模型構建與調(diào)控代謝通路定位工程,1.4 代謝網(wǎng)絡系統(tǒng)優(yōu)化與整體調(diào)控一般思路與方法,1.5 代謝網(wǎng)絡系統(tǒng)分析的一般方法及不足,代謝網(wǎng)絡系統(tǒng)分析方法：基于穩(wěn)態(tài)組學數(shù)據(jù)分析和預測靶點基于穩(wěn)態(tài)流量平衡分析的基因組規(guī)模代謝網(wǎng)絡模型預測限速步驟胞外重構代謝途徑分析合成動力學、鑒定限速步驟目前合成途徑起始階段動力學以及反應動力學模型的研究方法未建立

6、。,胞內(nèi)代謝物動力學是細胞代謝狀態(tài)最直接的體現(xiàn)，利用穩(wěn)態(tài)代謝網(wǎng)絡分析可發(fā)現(xiàn)代謝瓶頸/代謝異常，但不能解釋代謝瓶頸/代謝異常產(chǎn)生的原因。在穩(wěn)態(tài)代謝組學分析的基礎上，將動態(tài)代謝組學和合成途徑動力學模擬相結合能鑒定代謝瓶頸/異常及其產(chǎn)生原因，提高對限速步驟的調(diào)控能力。,Analyzing transcriptome, proteome and metabolome in steady state for identifying engine

7、ering target,2. 代謝調(diào)控B. subtilis 生產(chǎn)N-乙酰氨基葡萄糖(GlcNAc),醫(yī)藥領域，治療關節(jié)炎營養(yǎng)保健，延緩衰老化妝品，促進膠原蛋白生成,N-乙酰氨基葡萄糖應用領域,B. subtilis 作為生產(chǎn)菌株的優(yōu)勢,可用來生產(chǎn)食品安全級產(chǎn)品遺傳背景清晰代謝改造技術成熟不易受噬菌體污染，適于工業(yè)化生產(chǎn),2.1 氨糖合成途徑設計與構建—glmS和GNA1基因克隆表達,過量表達氨糖合成酶(GlmS)和6-磷酸

8、氨糖乙?；?GNA1)實現(xiàn)了氨基葡萄糖GlcN和N-乙酰氨基葡萄糖GlcNAc的初步積累(240 mg/L)。,枯草芽孢桿菌中GlcNAc合成與代謝途徑,,,nagP基因敲除流程圖,敲除nagP基因阻斷了GlcNAc由胞外向胞內(nèi)轉運敲除nagA、nagB和gamA三個基因進一步阻斷胞內(nèi)GlcNAc降解途徑促進GlcNAc胞外積累，產(chǎn)量提高了17倍,2.1 氨糖合成途徑設計與構建—GlcNAc轉運及分解代謝阻斷,驗證nagA、nag

9、B和gamA基因敲除成功,2.2 氨糖合成途徑優(yōu)化與調(diào)控—GlcNAc合成途徑(酶)定向進化,氨基葡萄糖合成酶GlmS結構模型,氨基葡萄糖N-乙?；窯NA1結構模型,突變體對細胞生長和GlcNAc合成的影響,2.2 氨糖合成途徑優(yōu)化與調(diào)控—GlcNAc合成關鍵酶表達調(diào)控,,GlmS和GNA1的啟動子系統(tǒng)優(yōu)化 (游離/整合表達、表達強度適配),構建基于DNA與鋅指蛋白質之間的特異性相互作用的支架系統(tǒng)對GlmS 和Gna1的表達進行區(qū)域化

10、調(diào)控,GlcNAc在3-L發(fā)酵罐上GlcNAc產(chǎn)量達20.6 g/L,2.2 氨糖合成途徑優(yōu)化與調(diào)控—葡萄糖轉運、代謝途徑調(diào)控,分別敲除glcP基因和EIIA(yyzE、ypqE)基因阻斷NPTS和PTS葡萄糖轉運系統(tǒng)利用PTS轉運系統(tǒng)更有利于GlcNAc合成，但丙酮酸積累，細胞生長慢敲除丙酮酸激酶(pyk)和PEP羧化酶(pckA)降低丙酮酸合成，GlcNAc產(chǎn)量提高60%,2.2 氨糖合成途徑優(yōu)化與調(diào)控—中心代謝途徑調(diào)控,分別敲

11、除ldh基因和eutD基因阻斷乳酸和乙酸的合成敲除alsS、alsD和bdhA阻斷乙偶姻的合成為保持氧化還原平衡，整合表達NADH氧化酶，在3-L發(fā)酵罐上GlcNAc產(chǎn)量達37g/L,表達anti-pfk sRNA，控制糖酵解模塊活性在中等水平(60%)表達anti-glmM sRNA，限制肽聚糖合成糖酵解模塊活性在中等水平(60%)共表達anti-pfk sRNA以及anti-glmM sRNA及Hfq蛋白，限制肽聚糖、糖

12、酵解模塊活性在低水平(30%),sRNA能夠有效限制GlcNAc合成競爭模塊（糖酵解及肽聚糖模塊）,2.3 氨糖代謝網(wǎng)絡系統(tǒng)優(yōu)化與調(diào)控-構建sRNA調(diào)控工具,通過將不同活性模塊進行優(yōu)化組裝，GlcNAc搖瓶產(chǎn)量達到8.30 g/L，在3-L發(fā)酵罐上產(chǎn)量達到42 g/L。,2.3 氨糖代謝網(wǎng)絡系統(tǒng)優(yōu)化與調(diào)控-基于sRNA的模塊調(diào)控,3. 基于代謝組學與合成途徑動力學模型的診斷方法的構建,穩(wěn)態(tài)代謝組學系統(tǒng)分析高產(chǎn)菌株與出發(fā)菌株的胞內(nèi)代謝差異

13、，鑒定代謝瓶頸和代謝異常動態(tài)代謝組學及合成途徑動力學模擬分析產(chǎn)物合成瓶頸產(chǎn)生原因13C同位素分析進一步驗證合成瓶頸，并進一步通過代謝調(diào)控解除代謝瓶頸,,,3.1 穩(wěn)態(tài)代謝組學解析細胞代謝特性,工程菌代謝物水平發(fā)生何種變化? F6P和Gln過量消耗是否影響菌體生長?,,F6P和Gln,,GlcNAc 合成,,中心碳代謝及氮代謝,GlcNAc合成途徑及野生菌株與GlcNAc過量合成菌株BSGN細胞生長比較,3.1 中心代謝產(chǎn)物譜定量

14、解析,濃度顯著變化代謝物,3.1 中心代謝產(chǎn)物譜定量解析,工程菌BSGN與野生菌B. subtilis 168胞內(nèi)代謝物變化,糖酵解途徑、氨基酸合成以及TCA循環(huán)代謝物水平顯著降低，F(xiàn)6P和Gln降低2倍以上 ；胞內(nèi)GlcNAcP 升高570倍。,,何種過量消耗前體(F6P或Gln)對工程菌BSGN代謝影響更為關鍵 ?,,,,,GlcNAc 合成及糖酵解途徑,TCA循環(huán),氨基酸合成,3.1 中心代謝產(chǎn)物譜定量解析,減少中心碳代謝F6P

15、對代謝變化的影響,在F6P代謝節(jié)點處減少底物對中心代謝途徑供給，對胞內(nèi)糖酵解途徑、氨基酸合成以及TCA循環(huán)的代謝物濃度無明顯影響。F6P供給非引起細胞生長和代謝變化的關鍵因素。,,F6P,,GlcNAc合成,在基因組Pfk引入突變(R252A)，降低其活性,,中心代謝,,Kinetics of PFK,Kinetics of PFK R252A mutant,,,,,如果F6P為關鍵因素，進一步減少F6P中心碳代謝水平應進一步降低。,

16、GlcNAc 合成及糖酵解途徑,TCA循環(huán),氨基酸合成,3.1 中心代謝產(chǎn)物譜定量解析,增加Gln供給對代謝變化的影響,代謝水平幾乎全部得到恢復，但細胞生長仍然較慢,,Pfk突變和GS過量表達對工程菌能荷水平是否有影響?,過量表達Gln合成酶，增加Gln供給,Gln,Glu,Ac-CoA,CoA,,Glucose,Glc-6-P,Fru-6-P,GlcN-6-P,GlcNAc-6-P,?,GlcNAc,,,,,,,Glycolysis,

17、GS,,GlcNAc 合成及糖酵解途徑,TCA循環(huán),氨基酸合成,3.1 中心代謝產(chǎn)物譜定量解析,Pfk 突變對細胞能荷無明顯影響；GlcNAc過量合成對中心碳、氮代謝的影響不是限制細胞生長的關鍵因素。,細胞能荷、比生長速率、比產(chǎn)物合成速率比較,3.1 中心代謝產(chǎn)物譜定量解析,,胞內(nèi)GlcNAc6P升高570倍,Glucose,Glc-6-P,Fru-6-P,PTS uptake pathway,過量磷酸糖對細胞有毒害作用:抑制葡萄糖

18、吸收避免過量磷酸糖積累可解除抑制作用。,Glucose,,GlcNAc合成過程中，GlcNAc途徑代謝物如何動態(tài)變化?,GlcNAc6P為工程菌產(chǎn)物合成及細胞生長的潛在瓶頸?,,4.1 GlcNAc合成途徑動力學分析,將動力學模型與系統(tǒng)生物學數(shù)據(jù)相結合是分析代謝調(diào)控機理的重要手段建立GlcNAc合成途徑動力學模型結合動態(tài)代謝組學鑒定合成途徑中的瓶頸驗證并且去除合成途徑中瓶頸進一步促進GlcNAc合成,4.2 GlcNAc合成途徑動

19、力學分析—動力學模擬,GlcNAc合成途徑化學計量數(shù)的微分方程組,4.2 GlcNAc合成途徑動力學分析—動力學模擬,無限速步驟,反饋抑制,某一反應速率低于其他反應速率,反應途徑中存在無效循環(huán),產(chǎn)物輸出能力不足,反應途徑末端存在無效循環(huán),4.2 GlcNAc合成途徑動力學分析—動力學模擬,不同限速步驟及其代謝途徑動力學特征：反饋抑制：代謝物濃度低于Km值，且無法達到穩(wěn)態(tài)；代謝途徑中存在限速反應及無效循環(huán)：上游代謝物積累；代謝

20、途徑末端存在無效循環(huán)：胞內(nèi)、胞外產(chǎn)物總濃度降低；產(chǎn)物輸出效率不足：胞內(nèi)產(chǎn)物積累。,𝑣(2)=𝑣(2)𝑚𝑎𝑥 𝑥(1) 𝐾𝑚2+𝑥(1),𝑣 1 =0 for time 1,𝑣(3)=𝑣(3)𝑚𝑎𝑥

21、 𝑥(2) 𝐾𝑚3+𝑥(3) ...,,4.3 GlcNAc合成途徑動力學分析—動態(tài)代謝組學,動態(tài)代謝組學測定：1) 通過底物添加，開啟產(chǎn)物合成途徑；2) GlcNAc比合成速率保持恒定，達到7.7 mg/g DCW/h。該GlcNAc比合成速率與重組菌BSGN在使用基本培養(yǎng)基進行搖瓶發(fā)酵時的GlcNAc比合成速率相近；3) 基于代謝組學采用快速取樣及高效

22、淬滅的方法對GlcNAc合成途徑開啟后2 min之內(nèi)的動力學進行分析。,,4.4 GlcNAc合成途徑動力學分析—限速步驟預測,,,氨糖途徑動力學變化符合GlcNAc-6-P與GlcNAc無效循環(huán)模型模擬特征F6P、AcCoA和Gln濃度大于途徑酶Km值，底物供給充足非限制性因素未知激酶催化胞內(nèi)GlcNAc的磷酸化生成6-P-GlcNAc,4.5 GlcNAc合成途徑動力學分析—預測結果驗證,若存在將胞內(nèi)GlcNAc磷酸化為GlcN

23、Ac-6-P的代謝流時，添加[U-13C]葡萄糖開啟GlcNAc合成途徑，GlcNAc-6-P來源于胞內(nèi)GlcNAc而不是[U-13C]葡萄糖。當添加[U-13C]葡萄糖開啟GlcNAc合成途徑后，未被13C標記的GlcNAc-6-P質量同模子M+0的分數(shù)始終保持在100%，而被13C標記的GlcNAc-6-P質量同模子M+6和M+8的分數(shù)沒有增加。,4.6 GlcNAc合成途徑動力學分析—限速步驟去除,B. subtilis已注釋基

24、因中尚無GlcNAc激酶的注釋。將E. coli中GlcNAc激酶的氨基酸序列與B. subtilis中106個激酶的氨基酸序列進行比對，發(fā)現(xiàn)葡萄糖激酶GlcK與E. coli中GlcNAc激酶的氨基酸序列相似度最高(26%)。敲除葡萄糖激酶編碼基因glcK，在基本培養(yǎng)基中細胞比生長速率(0.15 h-1)及氨糖生產(chǎn)強度(9.33 mg/L/h)為敲除前的2.1和2.3倍。,5、研究結論,建立GlcNAc合成途徑動力學模型，模擬不同限

25、速步驟存在時GlcNAc合成途徑由關閉到開啟狀態(tài)時動力學，并且鑒定了不同限速步驟存在時的動力學特征。通過控制底物葡萄糖添加，實現(xiàn)GlcNAc合成途徑由關閉到開啟。采用快速取樣、高效淬滅以及靶向代謝組學，實現(xiàn)對GlcNAc合成途徑開啟后2 min之內(nèi)的動態(tài)代謝組學測定。將實驗測定GlcNAc合成途徑動力學與動力學模擬結果比較，發(fā)現(xiàn)GlcNAc-6-P與胞內(nèi)GlcNAc之間存在無效循環(huán)為GlcNAc合成途徑潛在限速步驟。進一步使

26、用[U-13C]葡萄糖動態(tài)標記實驗證實了無效循環(huán)存在。通過敲除重組菌BSGN中葡萄糖激酶編碼基因glcK，胞內(nèi)GlcNAc轉化為GlcNAc-6-P的無效循環(huán)得以阻斷，細胞比生長速率和GlcNAc生產(chǎn)強度分別提高了2.1倍和2.3倍。,相關發(fā)表論文,Liu et al., Biotechnology and Bioengineering. 2015. In revisionLiu et al., Critical Reviews in

27、 Biotechnology. 2015. Accepted/In press. Yin et al., Biotechnology Advances. 2015. 33: 830-841.Liu et al., Applied Environmental Microbiology. 2015. 81:2256-2264Han et al., Biotechnology Advances. 2014. 32: 415-428.

28、Liu et al., Metabolic Engineering. 2014, 24: 61-69.Liu et al., Metabolic Engineering. 2014, 23: 42-52. Liu et al., Metabolic Engineering. 2013, 19: 107-115.Zhang et al., Metabolic Engineering. 2012, 14: 521-527.,謝謝！請