代謝工程手段改造釀酒酵母PP途徑提高木糖發(fā)酵能力.pdf

1、代謝工程手段改造釀酒酵母代謝工程手段改造釀酒酵母PP途徑提高木糖發(fā)酵能力途徑提高木糖發(fā)酵能力MetabolicEngineeringofPentosePhosphatePathwayfImprovingXyloseFermentationPerfmanceinSacomycescerevisiae學(xué)科專業(yè)：生物化工作者姓名：孫錦云指導(dǎo)教師：馬平生教授天津大學(xué)化工學(xué)院2013年06月摘要作為一種新型的可再生能源，木質(zhì)纖維素乙醇受到了社會各

2、界的廣泛關(guān)注。然而，傳統(tǒng)的乙醇生產(chǎn)菌株—釀酒酵母卻不能有效地利用木質(zhì)纖維素主要成分之一的木糖，僅能利用其異構(gòu)物木酮糖。因此，提高釀酒酵母木糖代謝能力以有效地共代謝葡萄糖和木糖成為木質(zhì)纖維素乙醇工業(yè)化生產(chǎn)的首要問題。本課題組在早期工作中成功構(gòu)建了高效的木糖代謝釀酒酵母菌株AYHNEW2，通過對其在不同培養(yǎng)基條件下的木糖發(fā)酵性能進(jìn)行比較研究發(fā)現(xiàn)，在混合糖發(fā)酵過程中，重組菌株的木糖代謝能力明顯降低。經(jīng)過系統(tǒng)分析，我們推測葡萄糖代謝產(chǎn)物乙醇的抑

3、制可能是導(dǎo)致木糖代謝速率降低的主要原因，而乙醇的抑制作用可能與非氧化磷酸戊糖（PP）途徑關(guān)健酶的活性有關(guān)。于是，在本研究工作中，我們從兩方面對釀酒酵母菌株AYHNEW2進(jìn)行改造：一方面，我們試圖通過缺失釀酒酵母糖酵解（EMP）途徑中的關(guān)鍵酶—6磷酸葡萄糖異構(gòu)酶PGI1，構(gòu)建專一化的木糖代謝釀酒酵母菌株AYHNEW2pgi1，從而消除葡萄糖對木糖代謝的抑制作用。結(jié)果顯示，在含有低濃度葡萄糖的木糖培養(yǎng)基上，重組菌株的生長極其緩慢，100h僅

4、能消耗約6%的葡萄糖，而高濃度的葡萄糖則會完全抑制重組菌株的生長。并且，在以木糖為唯一碳源的培養(yǎng)基中，重組菌株AYHNEW2pgi1的發(fā)酵性能也大幅降低；另一方面，我們試圖通過改造釀酒酵母PP途徑以提高其木糖發(fā)酵性能。根據(jù)早期研究工作，我們選擇了木糖代謝條件下的強(qiáng)啟動子pFBA1，pHXT7，pCCW12以及pGPM1來分別過表達(dá)PP途徑的基因RKI1，RPE1，TAL1以及TKL1，獲得了一系列具有不同PP途經(jīng)基因過表達(dá)水平的重組釀酒

5、酵母菌株，并對其木糖發(fā)酵性能進(jìn)行了比較研究。結(jié)果表明，過表達(dá)PP途經(jīng)基因能夠改善釀酒酵母木糖發(fā)酵性能和乙醇耐受能力，但在混合糖發(fā)酵過程中，其木糖代謝仍受到顯著的抑制。與此同時，在混合糖發(fā)酵產(chǎn)生的乙醇濃度范圍內(nèi)，重組菌株的木糖代謝僅受到了輕微的抑制，基本都能在48h到72h耗完5%的木糖。由此可見，乙醇抑制效應(yīng)不足以解釋混合糖發(fā)酵過程中木糖代謝速率大幅降低這一現(xiàn)象，在混合糖發(fā)酵過程中必定存在其他因素影響木糖的代謝，并且這一因素始終存在于整